兔源F型多杀性巴氏杆菌双重PCR检测方法的建立

作者：王锦祥; 孙世坤; 陈岩峰; 陈冬金; 桑雷; 谢喜平^*

来源：福建农业学报, 2021, 36(05): 501-505.

DOI：10.19303/j.issn.1008-0384.2021.05.001

• 兔
• F型多杀性巴氏杆菌
• kmt1基因
• fcbD基因
• 双重PCR检测方法

【目的】建立检测兔源F型多杀性巴氏杆菌的双重PCR检测方法,为兔巴氏杆菌病的诊断提供技术支持。【方法】根据多杀性巴氏杆菌kmt1基因和F型多杀性巴氏杆菌fcbD基因的保守序列分别设计了2对引物进行双重PCR扩增,对双重PCR检测方法的退火温度和混合引物浓度进行优化,并对方法的特异性、敏感性、重复性和准确性进行验证。【结果】该双重PCR方法最优反应条件为:退火温度60℃、混合引物浓度0.8μmol·L-1。该双重PCR方法能扩增出兔源F型多杀性巴氏杆菌的kmt1基因片段(260 bp)和fcbD基因片段(490 bp)、兔源A和D型多杀性巴氏杆菌的kmt1基因片段(260 bp),对兔源支气管败血波氏杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和阴性对照均为阴性,无交叉反应,特异性较强。该方法对兔源F型多杀性巴氏杆菌的最低检出限为1×103拷贝·μL-1,敏感性高。应用该方法对90份病死兔肺脏样品进行批内和批间重复性试验,结果均一致,重复性好。应用该双重PCR方法和已报道的多重PCR方法同时检测87份已知结果的呼吸道病死兔肺脏样品,结果显示双重PCR方法检测结果和已报道的多重PCR方法检测结果与已知结果的符合率分别为97.70%和94.25%,双重PCR方法检测结果与已报道的多重PCR方法检测结果的符合率为93.10%,双重PCR方法的准确性更高。【结论】针对多杀性巴氏杆菌kmt1基因和F型多杀性巴氏杆菌fcbD基因建立的双重PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和准确性,为兔源F型多杀性巴氏杆菌的快速检测提供了技术支撑。

• 单位
  福建省农业科学院