多色荧光探针的滚环扩增技术检测结核分枝杆菌耐药基因

作者：夏珂; 李梦雅; 田晖艳; 黄国荣; 谢凤欣; 张阳; 府伟灵^*

来源：中华预防医学杂志, 2022, 56(01): 56-62.

• 结核分枝杆菌
• 耐药性
• 荧光
• 滚环扩增
• 多重检测

本研究旨在构建基于核酸滚环扩增(RCA)的简便快速、超灵敏的光学生物传感技术, 并将其运用于结核杆菌耐药相关基因的多重检测。本研究在2020年2月至2021年5月期间, 于陆军军医大学第一附属医院检验科, 针对异烟肼、利福平和链霉素耐药的高频基因突变位点katG315(AGC?ACC)、rpoB531(CAC?TAC)和rpsL43(AAG?AGG), 分别设计锁式探针(padlock probe, PLP)、引物和捕获探针, 构建了基于磁珠的固相RCA恒温扩增反应体系, 并进行了实验参数的优化。通过多色荧光探针(Cy3/Cy5/ROX)对RCA产物精准捕获与信号放大, 实现了对3种突变基因的单管多重检测。进一步对该方法的灵敏度、特异性与线性范围等分析性能进行验证, 结果显示同一反应体系中katG315的响应范围为1.0 pmol/L至0.1 nmol/L, rpoB531和rpsL43的响应范围为1.0 pmol/L至50.0 pmol/L和1.0 pmol/L至20.0 pmol/L, 且该方法具有较好的特异度与灵敏度, 在混合靶标中可精确识别单碱基突变, 最低检出限低至1.0 pmol/L;在模拟血清样本的回收实验中, 回收率可达95.0%～105.2%。综上, 本研究构建的恒温扩增型多重检测方法可快速实现3种耐药突变位点的单管多重检测, 该技术成本低廉、简便快速、不依赖大型设备, 为病原体耐药基因检测提供了一种新的分析方法。

• 单位
  第一附属医院检验科; 中国人民解放军陆军军医大学; 重庆市肿瘤研究所