禽呼肠孤病毒微滴数字PCR检测方法的建立

作者：万丽军; 华俊; 谢芝勋^*; 王盛; 任红玉; 谢丽基; 范晴; 罗思思; 张艳芳; 曾婷婷; 黄娇玲; 张民秀; 谢志勤; 邓显文

来源：黑龙江畜牧兽医, 2023, (10): 80-139.

DOI：10.13881/j.cnki.hljxmsy.2022.06.0042

• 禽呼肠孤病毒
• 微滴数字PCR
• 敏感性
• 特异性
• 重复性
• 绝对定量

为了建立禽呼肠孤病毒(Avian reovirus, ARV)微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)的检测方法，试验根据ARV S1133毒株S1基因序列(GenBank登录号为L39002.1)的保守区设计特异性标准品引物BQ-F/BQ-R,检测引物ARV-F/ARV-R及特异性探针(ARV-Probe);以ARV S1133毒株反转录的cDNA为模板，使用引物BQ-F/BQ-R进行PCR扩增，构建标准品质粒pMD18-T-ARV;以标准品质粒pMD18-T-ARV为模板，使用引物ARV-F/ARV-R及特异性探针进行ddPCR试验，优化引物、探针反应浓度及退火温度，并考察ddPCR检测方法的敏感性、特异性及重复性。结果表明：筛选得到引物和探针的最佳反应浓度分别为1 000 nmol/L和250 nmol/L,最佳退火温度为57.1℃。建立的ARV ddPCR最低能检测到的模板浓度为8 copies/μL;同时检测禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、鸡细小病毒(ChPV)、鸡传染性贫血病毒(CIAV)、禽腺病毒(FAdV)及ARV,仅ARV为阳性，其他均为阴性；重复检测试验样品及临床样品3次，变异系数均小于15%。说明ddPCR可用于ARV的临床检测中。

• 单位
  广西壮族自治区兽医研究所