本发明属于生物技术领域,公开了一种从包涵体蛋白制备可溶性蛋白的方法。所述方法通过二次变性的过程,并且选择含精氨酸的碱性溶液作为第一次变性的变性剂,优选地以Triton辅助变性,从而最终蛋白的得率和纯度都远远高于单次变性的方法,且所获得的可溶性蛋白可良好地恢复天然态结构以及保持生物学活性。本发明的方法变性剂用量少,工作效率高,重组蛋白可以在先不经色谱纯化的条件下就达到较高的复性率,产品复性总收率在60%以上,工艺简单、产品收率高、成本低。