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摘要
背景研究表明盘状结构域受体2(DDR2)和基质金属蛋白酶-13(MMP-13)在肿瘤新生血管发生中具有重要作用,是相关疾病治疗的关键靶点,但DDR2和MMP-13在脉络膜新生血管(CNV)发生中的作用尚不清楚。目的探讨DDR2和MMP-13在大鼠CNV中的表达特点以及MEK/ERK和PI3K/Akt通路对DDR2及MMP-13表达的调控作用。方法采用532 nm倍频激光视网膜光凝法制备棕色挪威(BN)大鼠CNV模型,将78只BN模型鼠按照随机数字表法分为正常对照组(n=7)、模型对照组(n=39)、PD98059(MEK1抑制剂)组(n=16)和LY294002(PI3K抑制剂)组(n=16),PD98059组和LY294002组大鼠分别于光凝后1 d、7 d玻璃体内注射5 mmol/L PD98059 3 μl或5 mmol/L LY294002 3 μl。分别于光凝前和光凝后1、3、7、14 d用过量麻醉法处死动物并制备样本和切片,采用Western blot法检测各组大鼠眼杯中ERK、p-ERK、Akt和p-Akt蛋白的表达变化,采用逆转录PCR(RT-PCR)法检测各组大鼠眼杯中DDR2 mRNA和MMP-13 mRNA的表达变化,采用组织病理学方法测定各组大鼠CNV厚度,采用免疫组织化学和免疫荧光染色法分别定位和测定大鼠CNV区域DDR2和MMP-13的表达。结果光凝后3 d,光凝局部细胞增生,光凝后7 d CNV形成,至光凝后14 d CNV趋于稳定。免疫组织化学染色结果显示,DDR2在正常大鼠视网膜血管内皮细胞层、视网膜神经节细胞(RGCs)层和内核层细胞中呈弱表达,但在CNV中呈强阳性表达;MMP-13在正常对照组大鼠视网膜内界膜层、光感受器层和巩膜层均呈强阳性表达,在模型对照组中呈强阳性表达。免疫荧光结果显示,CNV组织中DDR2和MMP-13共表达。RT-PCR结果显示,模型对照组光凝后1、3、7、14 d DDR2 mRNA相对表达水平分别为55. 22±4. 03、47. 74±2. 23、14. 82±4. 56和5. 59±2. 47,MMP-13 mRNA相对表达水平分别为25. 54±3. 83、43. 51±4. 36、10. 90±4. 00和5. 23±3. 23,与正常对照组相比,差异均有统计学意义(均P<0. 05)。免疫荧光结果显示,模型对照组光凝后3、7、14 d大鼠CNV区DDR2相对荧光密度单位(RFU)值分别为2. 73±0. 53、5. 21±0. 31和3. 22±0. 33,MMP-13 RFU值分别为1. 66±0. 17、3. 57±0. 44和2. 67±0. 21,组间总体比较差异均有统计学意义(F=81. 01,P<0. 05;F=40. 31,P<0. 01);PD98059组和LY294002组光凝后14 d CNV区DDR2 RFU值分别为1. 14±0. 19和1. 03±0. 14,与模型对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0. 05),MMP-13 RFU值分别为1. 37±0. 25和1. 24±0. 20,与模型对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0. 05)。Western blot结果显示,模型对照组光凝后7 d眼杯中p-ERK和p-Akt水平升高,与正常对照组大鼠相比差异均有统计学意义(均P<0. 05);至光凝后14 d恢复至近正常水平,与正常对照组比较差异均无统计学意义(均P>0. 05)。PD98058组大鼠眼杯p-ERK水平明显下降,注射后7 d、14 d PD98058组大鼠眼杯中p-ERK表达的抑制率分别为71. 58%和65. 21%,PD98058组7 d与模型对照组7 d比较、PD98058组14 d与模型对照组14 d比较,差异均有统计学意义(均P<0. 05)。LY294002组大鼠眼杯中p-Akt表达水平明显下降,LY294002注射后7 d、14 d大鼠眼杯中p-Akt表达的抑制率分别为65. 62%和67. 04%,LY294002组7 d与模型对照组7 d比较、LY294002组14 d与模型对照组14 d比较,差异均有统计学意义(均P<0. 05)。各组眼杯中ERK和Akt的表达水平总体比较差异均无统计学意义(F=0. 62,P>0. 05;F=0. 81,P>0. 05)。模型对照组、PD98059组和LY294002组光凝后14 d大鼠CNV厚度分别为(119. 19±18. 03)、(51. 00±11. 29)和(59. 18±9. 00)μm,总体比较差异有统计学意义(F=29. 376,P<0. 05),与模型对照组比较,PD98059和LY294002注射后CNV厚度分别减少57. 21%和50. 34%,差异均有统计学意义(均P<0. 05)。结论 DDR2和MMP-13在大鼠CNV中表达上调,参与CNV的形成;MEK/ERK和PI3K/Akt通路通过参与调控DDR2和MMP-13在CNV局部的表达而抑制CNV的发生和进展。
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单位西京医院; 北京军区总医院; 第四军医大学
