Reg3β干扰载体的构建及在H9C2心肌细胞中的鉴定

作者：易波; 蔡玉立; 李俊峰; 包艳; 陈小琳; 文重远^*

来源：医学研究杂志, 2020, 49(08): 24-28.

• Reg3β基因
• 短发夹RNA
• 载体构建
• H9C2心肌细胞

目的构建再生基因蛋白3β(regenerating islet-derived protein 3 beta,Reg3β)干扰载体,并在H9C2大鼠心肌细胞中优化转染条件,鉴定抑制效果,为深入探索Reg3β在心血管疾病的作用提供有利的工具。方法设计合成Reg3β干扰序列,在5’端加入一个SacⅠ的酶切位点,3’端加入LOOP环序列和反向互补序列,构建pG1.2-Reg3βshRNA沉默载体。接着分别用Lipofectamine2000和Lipofectamine3000优化摸索转染大鼠H9C2心肌细胞的效率,以q-PCR和Western blot法检测H9C2细胞内Reg3β的表达量。结果设计合成了3对Reg3β干扰序列,从中筛选出抑制效率最高达67.93%的序列,酶切和测序结果证实成功构建了pG1.2-Reg3βshRNA。经过优化比较发现,pG1.2-Reg3βshRNA沉默载体Lipofectamine3000比例为1μg∶3μl时,其转染效率最高(50%以上)。q-PCR和Western blot法检测结果显示,最佳干扰载体在最高转染条件下可使H9C2细胞Reg3β表达量降低50%以上。结论成功构建了pG1.2-Reg3βshRNA沉默载体,并在H9C2细胞中有效干扰Reg3β的表达,可用于探讨Reg3β在心血管疾病中的作用。

• 单位
  武汉大学人民医院