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摘要
目的探讨Dynamin 3(DNM3)在胃癌中的作用机制及预后价值。方法采用生物信息分析、实验研究方法和回顾性队列研究方法。收集2013年1月至2018年7月福建医科大学附属协和医院收治的153例行根治性胃切除术胃癌患者的临床病理资料、新鲜胃癌及配对正常组织样本和石蜡切片, 行实时荧光定量聚合酶链式反应检测、免疫印迹实验、流式细胞周期实验、免疫组织化学染色检测和预后分析。收集癌症基因组图谱(TCGA)数据库的胃腺癌(STAD)数据集进行生物信息分析。观察指标:(1)胃癌中DNM3基因在TCGA-STAD中的表达情况。(2)胃癌中DNM3的突变和拷贝数改变。(3)胃癌中DNM3的启动子甲基化水平。(4)胃癌中DNM3、p53的蛋白相对表达量。(5)胃癌中DNM3相关性和富集性分析。(6)流式细胞周期G0/G1期、S期、G2/M期的比例。(7)胃癌中免疫细胞浸润和DNM3之间的相关性。(8)免疫组织化学染色检测与临床特征之间的相关性。(9)影响胃癌患者5年总生存率的独立因素分析。正态分布的计量资料以x±s表示, 多组间比较采用方差分析, 进一步两两比较采用LSD法;两组间比较采用t检验;偏态分布的计量资料以M(Q1, Q3)表示, 组间比较采用Mann-WhitneyU检验。计数资料以绝对数或百分比表示, 组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。配对样本采用威尔科克森符号秩检验。等级资料采用秩和检验。运用Pearson相关系数或Spearman相关系数检验两组的相关性。单因素和多因素分析采用COX比例风险回归模型。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线并计算生存率, 采用Log-Rank检验进行生存情况分析。使用Benjamini-Hochberg错误发生率校正对P值进行调整。结果 (1)胃癌中DNM3基因在TCGA-STAD中的表达情况。TCGA-STAD数据库中DNM3基因在27个肿瘤组织和配对正常组织中的表达水平分别为0.775(0.605, 1.161)和1.216(0.772, 1.681), 两者比较, 差异有统计学意义(Z=-2.64, P<0.05)。DNM3基因在笔者中心48对胃癌组织和配对正常组织中mRNA表达水平分别为4.370(2.870, 6.040)和2.520(0.850, 4.170), 两者比较, 差异有统计学意义(Z=-4.39, P<0.05)。(2)胃癌中DNM3的突变和拷贝数改变。TCGA-STAD数据库中16例胃癌患者发生DNM3突变或体细胞拷贝数改变, 其中6个错义突变, 1个截断突变, 8个拷贝数增加, 1个拷贝数减少。TCGA-STAD数据库370例胃癌患者中DNM3突变前后的mRNA表达水平分别为6.13(5.40, 7.08)和5.02(3.98, 5.46), 两者比较, 差异有统计学意义(Log2FC=-1.11, Z=-2.59, P<0.05)。(3)胃癌中DNM3的启动子甲基化水平。TCGA-STAD数据库中372例胃癌患者DNM3甲基化水平与DNM3 mRNA的检测结果显示:DNM3甲基化水平为0.198(-0.458, 0.301), DNM3 mRNA表达水平为6.014(5.141, 6.628), DNM3甲基化水平与DNM3 mRNA表达水平呈负相关(r=-0.38, P<0.05)。32例患者随访结果显示:16例DNM3高甲基化组和16例DNM3低甲基化组患者3年总生存率分别为18.8%和41.3%, 两者比较, 差异有统计学意义(风险比=1.40, P<0.05)。免疫印迹实验结果显示:AGS细胞用0、0.5、1.0 μmol/L 5-azacytidin处理后的DNM3相对表达量分别为0.270±0.020、0.357±0.051、0.599±0.039, 3组比较, 差异有统计学意义(F=57.84, P<0.05)。HGC-27细胞用0、0.5、1.0 μmol/L 5-azacytidin处理后的DNM3相对表达量分别为0.316±0.038、0.770±0.031、0.877±0.052, 3组比较, 差异有统计学意义(F=156.30, P<0.05)。(4)胃癌中DNM3、p53的蛋白相对表达量。免疫印迹实验结果显示:转染DNM3质粒和对照质粒的AGS细胞中DNM3、p53的蛋白相对表达量分别为0.688±0.047、0.872±0.041和0.249±0.029、0.352±0.020;转染DNM3质粒和对照质粒的AGS细胞比较, 上述蛋白相对表达量差异均有统计学意义(t=13.77, 19.74, P<0.05)。转染DNM3质粒和对照质粒的HGC-27细胞中上述蛋白相对表达量分别为0.969±0.069、1.464±0.081和0.456±0.048、0.794±0.052, 差异均有统计学意义(t=10.57, 12.06, P<0.05)。(5)胃癌中DNM3相关性和富集性分析。相关性分析结果显示:DNM3与胃癌中RBMS3、CNTN4、PDE1A基因呈正相关(r=0.52, 0.52, 0.50, P<0.05), 与SLC25A39、PAICS、GAPDH基因呈负相关(r=-0.41, -0.40, -0.40, P<0.05)。基因集富集分析结果显示:与核糖体和氧化磷酸化有关的基因集在DNM3低表达组中上调[富集分数(NES)=-3.30, -2.16, P<0.05], 而淋巴细胞和非淋巴细胞之间的免疫调节相互作用在DNM3高表达组中上调(NES=1.67, P<0.05)。基因本体论分析结果显示:DNM3低表达与有丝分裂姐妹染色体分离(编号:0000070)、无义介导衰变的核转录mRNA分解过程、姐妹染色体分离(编号:0000819)、核转录mRNA分解代谢过程、氧化磷酸化的调控有关(NES=-2.29, -3.10, -2.33, -2.56, -2.68, P<0.05)。京都基因与基因组百科全书分析结果显示:DNM3低表达在核糖体和氧化磷酸化中存在上调和串联(NES=-3.34, -2.21, P<0.05)。(6)流式细胞周期G0/G1期、S期、G2/M期的比例。流式细胞周期实验结果显示:转染pCMV-DNM3质粒的AGS细胞G0/G1期、S期、G2/M期的比例分别为65.1%±3.0%、17.3%±3.0%、17.6%±1.0%, 转染对照质粒的AGS细胞上述指标分别为53.4%±4.0%、26.3%±2.0%、20.3%±3.0%。转染DNM3质粒与转染对照质粒的AGS细胞比较, G0/G1期、S期差异均有统计学意义(t=4.05, 4.32, P<0.05)。(7)胃癌中免疫细胞浸润和DNM3之间的相关性。免疫细胞浸润实验结果显示:DNM3 mRNA表达水平与肥大细胞, NK细胞, pDCs, B细胞, 滤泡辅助T细胞, 有效记忆T细胞, T细胞, 中央记忆T细胞, CD8 T细胞, DC细胞, 巨噬细胞, γ-δT细胞(Tgd), iDCs, 嗜酸性粒细胞浸润水平呈正相关(Spearman相关系数分别为0.41, 0.29, 0.26, 0.20, 0.22, 0.22, 0.13, 0.16, 0.15, 0.14, 0.14, 0.17, 0.18, 0.22, P<0.001, <0.001, <0.001, <0.001, <0.001, <0.001, P=0.015, 0.002, 0.004, 0.005, 0.005, P<0.001, <0.001, <0.001);与Th17细胞, Th2细胞, NK CD56dim细胞浸润水平呈负相关(r=-0.18, -0.23, -0.10, P<0.001, P=0.001和P=0.046)。(8)免疫组织化学染色检测与临床特征之间的相关性。免疫组织化学分析结果显示:DNM3在105例胃癌组织和105例配对正常组织中的免疫组织化学染色评分分别为3(2, 4)分和6(4, 9)分, 差异有统计学意义(Z=-7.35, P<0.05)。70例DNM3低表达与35例DNM3高表达胃癌患者性别、肿瘤部位、N分期比较, 差异均有统计学意义(χ2=4.29, 7.67, 6.86, P<0.05)。(9)影响胃癌患者5年总生存率的独立因素分析。多因素分析结果显示:病理学T分期为T3～4期和DNM3染色评分低是胃癌患者5年总生存率的独立危险因素(风险比=1.91, 0.51, 95%可信区间为1.06～3.43, 0.26～0.98, P<0.05)。DNM3低表达组胃癌患者和高表达组胃癌患者的5年总生存率分别为44.3%和65.7%, 两者比较, 差异有统计学意义(χ2=5.02, P<0.05)。结论 DNM3是一种肿瘤抑制因子, 也是胃癌预后不良的独立预测因子, 它可能通过甲基化调控胃癌的细胞周期和肿瘤微环境中的免疫抑制。
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单位福建医科大学附属协和医院
