HSP90β干扰和过表达慢病毒载体的构建及其在骨肉瘤细胞Saos-2中的表达

作者：舒雄; 刘辉琦; 杰永生; 郑蕊; 綦惠; 陈磊; 靳少锋; 冉宇靓^*

来源：现代肿瘤医学, 2020, 28(07): 1057-1062.

DOI：10.3969/j.issn.1672-4992.2020.07.001

• 骨肉瘤细胞
• HSP90β
• 慢病毒载体
• RNA干扰
• 过表达

目的:获得热休克蛋白90β(HSP90β)基因干扰和过表达慢病毒表达系统,并检测其在人骨肉瘤细胞株Saos-2中的表达水平。方法:设计合成shRNA,以慢病毒表达质粒构建HSP90β干扰和过表达载体,酶切电泳、测序技术鉴定载体构建是否成功。重组病毒转染H1299细胞,以嘌呤霉素筛选稳定转染的Saos-2细胞,通过荧光显微镜观察计数获得转染效率。将感染好的细胞分为干扰NC组(NEG-shRNA)、干扰组(shRNA-HSP90β)、过表达NC对照组(NEG-pEZ)及过表达组(pEZ-HSP90β)。通过qRT-PCR与Western blotting分别从mRNA和蛋白表达水平验证目的基因的干扰和过表达水平。结果:插入慢病毒表达载体的基因片段与目的基因的碱基序列完全一致。病毒包装成功后,嘌呤霉素最小致死浓度1μg/ml,感染复数200,感染人Saos-2的感染效率达80%,其中shRNA-HSP90β组干扰效率为86.35%,pEZ-HSP90β组的mRNA相对表达量增加2. 8倍。进一步研究发现,shRNA-HSP90β组较NEG-shRNA组中HSP90β蛋白表达明显降低,p EZ-HSP90β组较NEG-p EZ组HSP90β蛋白表达增加。结论:HSP90β基因干扰和过表达慢病毒载体构建成功,并能够在Saos-2中稳定表达。

• 单位
  北京市创伤骨科研究所; 北京积水潭医院; 中国医学科学院北京协和医学院; 青海大学