嗜热厌氧杆菌Ana.Pif1解旋酶核心结构域蛋白与DNA底物结合的反应特性

作者：段晓雷; 许欢; 姚淼; 曾洁; 申丽; 刘娜女; 张涛^*; 肖代敏^*

来源：贵州医科大学学报, 2018, 43(11): 1269-1278.

DOI：10.19367/j.cnki.1000-2707.2018.11.006

• Pif1解旋酶
• 嗜热厌氧棒菌
• 荧光偏振技术
• 结合反应

目的:探究嗜热厌氧杆菌的Ana. Pif1解旋酶核心结构域蛋白(Ana. Pif1-HD)与DNA底物结合的反应特性。方法:利用DNAman、Cluxtal X等软件,对Ana. Pif1的核心结构域蛋白进行系统进化树分析与同源序列比对; Ana. Pif1-HD表达载体构建后转入大肠杆菌进行原核表达,并通过Ni-NTA、SUMO酶切、S200分子筛等层析柱纯化获得Ana. Pif1-HD蛋白;利用Stopped-flow FRET技术监测Ana. Pif1-HD蛋白的解旋活性,利用荧光偏振检测技术分析Ana. Pif1-HD与不同长度、不同结构DNA底物的结合反应各向异性值,并进行拟合分析与统计。结果:Ana. Pif1的核心结构域蛋白为靠近N-端的448氨基酸,通过原核表达与纯化获得纯度为97%、浓度为5 g/L的Ana. Pif1-HD蛋白,并利用Stopped-flow FRET与荧光偏振等技术验证其具有Ana. Pif1全长蛋白90%的解旋活性与95%的结合活性; Ana. Pif1-HD的最佳结合反应条件是42℃在pH 6. 0含20 mmol/L Na Cl及3 mmol/L MgCl2的溶液中进行; Ana. Pif1-HD与不同长度ss DNA底物结合时的解离速率常数递增,并明确其ssDNA的binding-size为10. 34 nt;研究首次揭示Ana. Pif1-HD与不同复制中间体DNA结合反应的底物特异性ssG4 DNA> G4 DNA> 3’-ssDNA-dsDNA≈Y-型>其它底物。结论:成功表达纯化具有全长活性的Ana. Pif1解旋酶核心结构域蛋白,首次揭示该解旋酶核心蛋白与各类不同DNA底物的结合反应特性。

• 单位
  西北农林科技大学; 遵义医科大学; 生命科学学院