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摘要
目的通过CRISPR/Cas9技术矫正乙型血友病病人诱导多能干细胞(iPSCs)的点突变基因缺陷,进一步证明CRISPR/Cas9技术用于遗传性疾病基因矫正的有效性,并为乙型血友病的基因细胞疗法提供参考依据。方法首先,提取乙型血友病病人来源iPSCs基因组DNA,扩增凝血因子IX的8个外显子区域,并测序。其次,根据测序结果设计4条sg RNA,构建CRISPR/sg RNA质粒,并在293T细胞上进行剪切能力验证,挑选出一条具有较高剪切效率的sgR NA。同时根据突变位点设计129个核苷酸的含两个同义突变位点的单长链寡聚核苷酸(ss ODN),作为同源修复模板。再次,通过电击转染的方式将CRISPR/sg RNA质粒和ss ODN导入iPS细胞内,低密度种板,嘌呤霉素筛选48 h,再培养5~7 d。然后,挑取55个单克隆,PCR扩增目标序列并直接测序筛选矫正克隆。通过在线软件,选择8个具有较高脱靶风险的位点,分别进行脱靶效应分析。最后,将矫正克隆在体外分化成肝脏细胞,用免疫荧光和酶联免疫法检测凝血因子IX的表达。结果 PCR测序结果显示该样本为6号外显子的点突变样本(c.676 C>T)。通过CRISPR/Cas9技术,成功测序45个克隆,筛选到了10个按照同源模板发生精确矫正的克隆,矫正效率达到了22%(10/45),并且未发现脱靶效应。最后我们对矫正克隆进行了为期21 d的肝细胞分化,ELISA结果显示,在分化末期凝血因子IX的表达可以达到6 ng/ml。结论采用CRISPR/Cas9系统和长度为129个核苷酸的含两个同义突变的单链寡聚核苷酸,成功矫正了原乙型血友病iPS细胞株的致病点突变。这种人类乙型血友病的原位基因矫正方法为乙型血友病的基因细胞疗法提供了新的可能性。
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单位中国医学科学院北京协和医学院; 实验血液学国家重点实验室
