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摘要
目的观察调控微小RNA-155(miR-155)对脂多糖(LPS)诱导大鼠肺泡巨噬细胞炎症反应的影响。方法体外培养大鼠肺泡巨噬细胞NR8383,取处于对数生长期的细胞进行实验。①以1 mg/L的LPS分别刺激大鼠肺泡巨噬细胞3、6、12、24 h,并设磷酸盐缓冲液(PBS)对照组。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清液中炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的动态变化,采用实时定量反转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测细胞中miR-155的动态表达,确定LPS刺激的最佳时间为12 h。②应用羧基荧光素(FAM)荧光标记的模拟物(FAM mimic)和抑制物(FAM inhibitor)分别转染肺泡巨噬细胞6 h,倒置荧光显微镜下观察转染效果,确定mimic的最佳转染浓度为20 nmol/L, inhibitor的最佳转染浓度为100 nmol/L。按最佳转染浓度将miR-155 mimic、miR-155 inhibitor分别转染至肺泡巨噬细胞24 h后,给予1 mg/L的LPS刺激细胞12 h,并设mimic阴性对照+LPS组和inhibitor阴性对照+LPS组。采用ELISA法检测细胞上清液中IL-1β、TNF-α的表达,观察miR-155对肺泡巨噬细胞炎症反应的调控作用。结果①用1mg/L的LPS刺激肺泡巨噬细胞后,细胞上清液中IL-1β、TNF-α含量和细胞中miR-155的表达均随时间延长而呈持续升高趋势,IL-1β和TNF-α含量于12h达峰值,miR-155表达于24h达峰值[与PBS对照组比较,IL-1β(ng/L):910.43±36.09比22.66±7.84, TNF-α(ng/L):3 138.39±394.10比233.92±8.84, miR-155(2-△△Ct):7.82±0.30比1,均P<0.05]。②倒置荧光显微镜下显示,采用20 nmol/L FAM mimic或100 nmol/L FAM inhibitor转染肺泡巨噬细胞6 h后,大量细胞呈现绿色荧光,提示转染成功。采用20 nmol/L的miR-155 mimic转染细胞24h后细胞中miR-155表达较其阴性对照组上调了(236.73±46.49)倍(P<0.05),加入1 mg/L的LPS刺激细胞24 h后上清液中IL-1β、TNF-α含量较其阴性对照组显著降低[IL-1β(ng/L):324.37±36.59比799.31±39.44,TNF-α(ng/L):1554.01±342.48比3020.49±418.30,均P<0.05];而用100 nmol/L的miR-155 inhibitor转染细胞24 h后细胞中miR-155活性被明显抑制,其表达较其阴性对照组下降了(4.00±3.26)%,但差异无统计学意义(P>0.05),加入1 mg/L的LPS刺激细胞12 h后细胞上清液中IL-1β、TNF-α含量均较其阴性对照组显著升高[IL-1β(ng/L):1358.98±212.04比878.68±53.42, TNF-α(ng/L):4 225.57±281.11比2 881.32±286.08,均P<0.05]。结论在LPS诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应中,miR-155能够起到明显的抑制作用。
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