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摘要
目的探讨七氟烷对大鼠肾缺血再灌注损伤的影响及其作用机制。方法选取6～8周龄、体质量(250±30)g雄性SD大鼠40只, 按数字表法随机分成假手术组(Sham组)、肾缺血再灌注组(IR组)、七氟烷预处理组(Sev组)、七氟烷预处理+沉默信号调节因子1(SIRT1)抑制剂组(EX组)4组, 每组10只。肾缺血再灌注损伤模型制备前2天和术前10 min, Sham组、IR组、Sev组大鼠腹腔注射1% 二甲基亚砜(DMSO)溶液(5 mL/kg), EX组腹腔注射含抑制剂EX-527(1 mg/mL)的1% DMSO溶液(5 mL/kg)。Sham组:切除右侧肾脏, 暴露左侧肾脏但不夹闭肾蒂;IR组:切除右侧肾脏, 制备左侧肾脏缺血再灌注模型;Sev组、EX组:先吸入七氟烷45 min后, 再按IR组方法制备缺血再灌注模型。于制备缺血再灌注模型术后3 h, 收集各组大鼠肾脏组织与左心室血液, 取材后以颈椎脱位法处死大鼠。观察项目:(1)检测各组大鼠左心室血液血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)。(2)制备各组大鼠肾脏组织病理切片, 光镜下观察肾组织病理变化, 对肾小管按Paller评分标准进行评分, 评估肾脏损伤情况。(3)采用原位末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口末端标记技术(TUNEL)检测各组大鼠肾脏组织细胞凋亡情况。(4)取各组大鼠肾脏组织病理切片, 在透射电子显微镜下观察肾脏组织自噬情况。(5)采用蛋白质印迹法(Western blotting)检测各组大鼠肾脏组织SIRT1、叉头盒转录因子O3(FoxO3)蛋白, 以及凋亡蛋白(BAX/Bcl-2)、自噬相关蛋白(Beclin1、LC3A/B)的表达水平。结果 (1)Sham组大鼠血清Scr和BUN分别为(50.74±5.91)μmol/L和(10.11±0.80)mmol/L, IR组分别为(90.18±11.22)μmol/L和(53.39±6.29)mmol/L, Sev组分别为(63.70±8.69)μmol/L和(27.68±3.41)mmol/L, EX组分别为(80.18±9.15)μmol/L和(33.20±3.57)mmol/L。与Sham组相比, IR组、Sev组、EX组血清Scr、BUN水平均升高;与IR组相比, Sev组、EX组血清Scr、BUN水平均下降;与Sev组相比, EX组血清Scr、BUN 水平均升高:差异均有统计学意义(P值均<0.05)。(2)Sham组肾小球和肾小管形态结构基本正常;IR组肾小管上皮组织肿胀明显, 肾小管细胞排列紊乱, 大量细胞核固缩, 大量中性粒细胞浸润;Sev组:肾小管上皮细胞轻中度肿胀, 少见核固缩坏死, 中性粒细胞浸润明显减少;EX组:肾小管上皮组织肿胀明显, 细胞核固缩和溶解增多, 中性粒细胞浸润较多。Sham组、IR组、Sev组、EX组肾小管Paller评分分别为(0.61±0.15)、(5.05±0.55)、(2.68±0.33)、(4.51±0.49)分。与Sham组比较, IR组、Sev组、EX组Paller评分均升高;与IR组比较, Sev组、EX组Paller评分均下降;与Sev组相比, EX组Paller评分升高:差异均有统计学意义(P值均<0.05)。(3)Sham组、IR组、Sev组、EX组细胞凋亡率分别为8.71%±0.68%、38.15%±2.23%、14.51%±2.02%、32.55%±2.89%。与Sham组比较, IR组、Sev组、EX组细胞凋亡率均升高;与IR组比较, Sev组、EX组细胞凋亡率下降;与Sev组比较, EX组细胞凋亡率升高:差异均有统计学意义(P值均<0.05)。(4)与Sham比较, IR组、Sev组、EX组大鼠肾组织自噬小体数量均增加;与IR组比较, Sev组、EX组自噬小体数量增加且体积增大;与Sev组比较, EX组自噬小体数量明显减少:差异均有统计学意义(P值均<0.05)。(5)与Sham组比较, IR组和EX组大鼠肾脏组织FoxO3、Beclin1、LC3A/B蛋白、BAX/Bcl-2蛋白的相对表达量均升高, SIRT1的相对表达量均降低;Sev组SIRT1、FoxO3、Beclin1、LC3A/B、BAX/Bcl-2蛋白的相对表达量均升高:差异均有统计学意义(P值均<0.05)。与IR组比较, Sev组SIRT1、Beclin1、LC3A/B蛋白的相对表达量均升高, FoxO3、BAX/Bcl-2蛋白的相对表达量均降低;EX组SIRT1蛋白的相对表达量升高, FoxO3、BAX/Bcl-2蛋白的相对表达量均降低:差异均有统计学意义(P值均<0.05)。与Sev组比较, EX组SIRT1、Beclin1、LC3A/B蛋白的相对表达量均降低, FoxO3、BAX/Bcl-2蛋白的相对表达量均升高, 差异均有统计学意义(P值均<0.05)。结论七氟烷可通过促进自噬, 抑制细胞凋亡, 减轻大鼠肾缺血再灌注损伤, 其机制可能与激活SIRT1/FoxO3信号通路有关。
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