PAX3基因沉默对P19细胞向心肌样细胞分化的影响及其机制

作者：万朝辉; 曾良; 李晶; 雷长城^*

来源：吉林大学学报(医学版), 2023, 49(03): 647-655.

DOI：10.13481/j.1671-587X.20230313

• P19细胞
• 配对盒转录因子3
• Notch信号通路
• 心肌样细胞

目的:探讨配对盒转录因子3 (PAX3)基因沉默对P19细胞向心肌样细胞分化的影响,并阐明其可能作用机制。方法:采用二甲基亚砜(DMSO)诱导P19细胞向心肌样细胞分化,观察诱导分化过程中细胞形态表现,并收集诱导分化第0天(0d组)和第10天(10 d组)的细胞。采用shPAX3慢病毒感染P19细胞,将细胞分为对照组、sh-NC组(阴性对照)和sh-PAX3组(PAX3干扰),实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法和Western blotting法检测PAX3基因沉默的P19细胞构建情况。采用Notch信号激动剂Jagged1处理慢病毒感染后的P19细胞,并采用DMSO诱导分化10 d,将细胞分为DMSO组、DMSO+sh-NC组、DMSO+sh-PAX3组、DMSO+Jagged1组和DMSO+sh-PAX3+Jagged1组。RT-qPCR法检测各组细胞中GATA结合蛋白4 (GATA4)、心房利钠尿多肽(ANP)、心肌肌钙蛋白(cTn) T、PAX3、Notch1、Notch胞内结构域(NICD)及Hes家族bHLH转录因子1(Hes1) mRNA表达水平。Western blotting法检测各组细胞中PAX3、Notch1、NICD和Hes1蛋白表达水平。免疫荧光染色法检测各组细胞中cTnI阳性表达情况和心肌样细胞分化率。结果:诱导分化第10天,可观察到自发性节律收缩的心肌样细胞簇。RT-qPCR和Western blotting法检测,慢病毒感染后,与对照组和sh-NC组比较,sh-PAX3组P19细胞中PAX3 mRNA和蛋白表达水平均降低(P<0.05),表明PAX3基因沉默的P19细胞构建成功。RT-qPCR法检测,与0d组比较,10 d组细胞中GATA4、ANP和cTnT mRNA表达水平均升高(P<0.05),PAX3、Notch1、NICD和Hes1 mRNA表达水平均升高(P<0.05);与DMSO组和DMSO+sh-NC组比较,DMSO+sh-PAX3组细胞中GATA4、ANP和cTnT mRNA表达水平均降低(P<0.05),DMSO+Jagged1组细胞中GATA4、ANP和cTnT mRNA表达水平均升高(P<0.05);与DMSO+sh-PAX3组比较,DMSO+shPAX3+Jagged1组细胞中GATA4、ANP和cTnT mRNA表达水平均升高(P<0.05)。Western blotting法检测,与0d组比较,10 d组细胞中PAX3、Notch1、NICD和Hes1蛋白表达水平均升高(P<0.05);与DMSO组和DMSO+sh-NC组比较,DMSO+sh-PAX3组细胞中Notch1、NICD和Hes1蛋白表达水平均降低(P<0.05),DMSO+Jagged1组细胞中Notch1、NICD和Hes1蛋白表达水平均升高(P<0.05);与DMSO+sh-PAX3组比较,DMSO+sh-PAX3+Jagged1组细胞中Notch1、NICD和Hes1蛋白表达水平均升高(P<0.05)。免疫荧光法检测,慢病毒感染后,各组细胞中均有cTnl蛋白阳性表达,与DMSO组和DMSO+sh-NC组比较,DMSO+sh-PAX3组细胞中cTnI蛋白阳性表达减少,心肌样细胞分化率降低(P<0.05);与DMSO组和DMSO+sh-NC组比较,DMSO+Jagged1组细胞中cTnI蛋白阳性表达增加,心肌样细胞分化率升高(P<0.05);与DMSO+sh-PAX3组比较,DMSO+sh-PAX3+Jagged1组细胞中cTnI蛋白阳性表达增加,心肌样细胞分化率升高(P<0.05)。结论:PAX3基因沉默可抑制P19细胞向心肌样细胞分化,其机制可能是通过降低PAX3基因表达抑制Notch信号通路活化实现的。

• 单位
  南华大学