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摘要
为研究甲基胞嘧啶双加氧酶2(tet methylcytosine dioxygenase 2,TET2)及其介导的羟甲基化修饰在调控天然免疫反应中的作用，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建TET2基因敲除的鸡胚成纤维细胞系。针对鸡TET2 mRNA的2种剪接变体的共有CDS序列设计4组sgRNA，构建sgRNA表达质粒，连同Cas9-T2A-GFP质粒共转染DF-1细胞，筛选高切割效率的sgRNA；将转染该sgRNA的DF-1细胞，进行流式细胞分选，获取表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的细胞，再通过有限稀释法筛选单克隆细胞，并用DNA测序进行鉴定。单克隆敲除细胞扩大培养后，Western blot和Dot blot检测TET2蛋白的表达水平和羟甲基化（5hmC）水平。DNA测序结果表明，TET2-gRNA-2靶位点附近分别发生2和28 bp的缺失突变，引起TET2蛋白移码突变，将该细胞株命名为DT-6。DT-6细胞传代15次以上，细胞形态稳定。Western blot结果显示，与DF-1细胞相比，DT-6细胞几乎不表达TET2蛋白。Dot blot结果显示，与DF-1细胞相比，DT-6细胞全基因组羟甲基化水平显著降低。利用CRISPR-Cas9技术成功构建了敲除TET2基因的鸡胚成纤维细胞系，为研究鸡TET2及其介导羟甲基化修饰参与调控天然免疫反应的途径和分子机制奠定基础。
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