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摘要
目的制备出具备生物学活性的羊膜粉并探索其保存条件, 探讨该羊膜粉制成的羊膜-纤维蛋白胶泥(AM-FS)对兔重度眼表碱烧伤模型的疗效。方法实验研究。取新鲜羊膜风干后液氮冷却研磨成颗粒直径<260 μm的羊膜粉并进行灭菌。检测该羊膜粉制备后及不同温度[室温(25℃)、4 ℃、-20 ℃]下保存10、20、30 d后转化生长因子β(TGF-β)、神经生长因子受体(NGFR)、肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)及碱性成纤维生长因子(bFGF)的表达, 并与新鲜羊膜进行比较。倍比稀释制备0.125～65 mg/ml共10种羊膜粉浓度及不含羊膜粉的AM-FS, 将兔角膜上皮细胞(CEC)置于其中培养72 h, 选取波长450 nm处的吸光度(A)值最大者, 以其羊膜粉浓度进行后续动物实验。将32只兔(32只右眼)制作重度眼表碱烧伤模型, 采用随机数表法分为AM-FS组、新鲜羊膜移植组、纤维蛋白胶(FS)组及抗生素对照组每组8只兔(8只眼), 给予不同眼表干预手段, 之后每周观察角膜修复情况, 第28 d取材行HE染色观察角膜组织, 并行免疫组织化学染色观察单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达。对生长因子或受体的表达差异倍数进行对数处理后得到的logFC值并用BH法校正;采用t检验及方差分析对数据进行统计学分析。结果羊膜粉中TGF-β与NGFR的表达量低于新鲜羊膜, logFC分别为-0.11、-2.07。羊膜粉中HGF、EGF、bFGF的表达量均高于新鲜羊膜, logFC分别为0.72, 0.46, 2.62(P<0.05);保存10、20 d的羊膜粉中HGF、bFGF、EGF的表达均不低于新鲜羊膜;30 d时羊膜粉除HGF、bFGF外其余生长因子或受体的表达较新鲜羊膜下降, 室温保存者HGF、bFGF、EGF的表达均不低于4 ℃和-20 ℃保存者。CEC培养72 h后0.25 mg/ml的羊膜粉的A值最大(0.98±0.05)。AM-FS组与新鲜羊膜移植组角膜恢复情况较好, 第28 d的角膜混浊程度评分分别为(3.75±0.46)和(3.50±0.46)分, 低于抗生素对照组的(4.29±0.45)分(t=2.480, 3.629;P=0.019, 0.001), 而两者间的差异无统计学意义(t=1.148, P=0.261)。抗生素对照组的角膜新生血管面积与其他3个组比较, 差异均有统计学意义(t=4.040, 4.339, 2.820;均P<0.01);干预后7和28 d, AM-FS组的角膜新生血管面积分为(9.88±0.20)和(18.96±0.18)mm2, 均大于新鲜羊膜移植组的(9.54±0.22)和(18.08±0.96)mm2(t=3.085, 3.017;均P<0.01), 而在第14和21 d两组差异无统计学意义(P>0.05)。光镜下可见AM-FS组和新鲜羊膜移植组的角膜结构完整, 上皮细胞排列趋于正常, 角膜愈合优于FS组和抗生素对照组。VEGF在新鲜羊膜移植组的阳性表达弱于其余3个组;MCP-1在AM-FS组和新鲜羊膜移植组的表达水平相似。结论本研究制备的风干羊膜粉中活性生长因子表达量高, 性质稳定可室温保存;羊膜粉浓度为0.25 mg/ml的AM-FS可促进兔眼碱烧伤后角膜上皮的修复、减轻炎性反应及角膜新生血管。
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