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摘要
背景组织工程角膜学的发展为角膜盲的治疗提供了新的选择,但目前暂未发现培养方法简单、可行性好的角膜上皮种子细胞和理想的支架材料。研究表明,脂肪源性干细胞(ADSCs)具有自我更新能力同时也具有类上皮的特质,而温度敏感性材料(TRSs)作为支架进行干细胞培养也为细胞层片技术的进步提供了技术支撑。目的研究兔ADSCs在TRSs上的培养特性,并与经典的口腔黏膜上皮细胞(OMECs)特性进行比较,探讨ADSCs作为眼表重建种子细胞的可行性。方法异丙基丙烯酰胺溶于二丙醇后均匀涂于直径35 mm的聚苯乙烯培养皿表面,利用电子束照射制备TRSs,兔颈背部皮下脂肪组织23 g经消化培养后获得A:DSCs,同时取出兔口腔黏膜组织进行消化培养,获得OMECs。将2种干细胞均接种于TRSs上继续培养,比较2种细胞形态、生长速度、脱附时间和成活细胞的总计数,将ADSCs层片和OMECs层片行组织病理学检查,观察2种细胞的形态特征;采用免疫组织化学法检测2种细胞中干细胞标志物和上皮细胞标志物的表达;应用扫描电子显微镜检查2种细胞层片的表面超微结构。结果自制17RSs透明性和光滑度与普通培养皿接近,任意观察的5个样品中有4个水接触角>10。,成功率为80%。TRSs上培养的ADSCs呈长梭形,OMECs呈不规则圆形。ADSCs生长周期在TRSs上为1214 d,脱附时间为(46.0±9.6)rain,细胞总计数为(7.9±1.1)×105/片,而’rRSs培养的OMECs生长周期为1416 d,脱附时间为(91.9±10.9)min,细胞计数为(45.8±26.5)×105/片,2种细胞间层片脱附时间和细胞计数的差异均有统计学意义(P=0.002、0.028)。组织病理学检查显示,TRSs上的ADSCs呈13层排列,而OMECs呈45层覆层结构。免疫组织化学染色显示,ADSCs和OMECs细胞层片细胞角蛋白12(CK12)及干细胞标志物p63、ATP结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)均呈阳性表达。扫描电子显微镜下观察可见ADSCs和OMECs表面均有致密的上皮微绒毛结构,细胞间连接紧密。结论自制的rRSs可作为脂肪干细胞的培养支架,ADSCs取材广泛,’IRSs上培养的ADSCs层片细胞活力好,可操作性强,可作为眼表重建新的种子来源。
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