基因编辑外源基因Cas9定性定量检测方法的研究

作者：丁霖; 王颢潜; 张敏; 王雨玲; 汪小福; 陈笑芸; 徐俊锋; 张秀杰^*; 彭城^*

来源：农业生物技术学报, 2022, 30(10): 1855-1868.

• 基因编辑技术
• 常规PCR
• qPCR
• Cas9

对基因编辑产品进行有效监管、消除公众疑虑是基因编辑产品在我国产业化的前提。目前，Cas9核酸内切酶是基因编辑技术中最常用的手段，因此需要建立针对Cas9核酸内切酶的定性定量检测方法。本研究以基因编辑中最常用的Cas9核酸内切酶外源序列为靶位点，设计和筛选引物、探针，进行PCR体系优化，确定最佳的引物浓度与退火温度，通过特异性、灵敏性等测试建立了检测基因编辑外源基因Cas9的普通PCR和qPCR检测方法。在检测方法特异性实验中，普通PCR和qPCR方法均只在含有Cas9等外源DNA的样品中扩增出了阳性结果，而其他不含有Cas9核酸内切酶的样品则均为阴性结果；在方法灵敏性测试中，普通PCR检测方法的检出限为0.1%,q PCR法检测下限(limit of detection, LOD)为16个拷贝；在方法稳定性实验中，普通PCR和qPCR方法在其相应最低检出限浓度下分别进行了67与60次重复实验，结果均为阳性。该定性定量方法适用于不同基因编辑作物，如水稻(Oryza sativa)、大豆(Glycine max)和油菜(Brassica napus)等。本研究建立的Cas9定性及定量检测方法特异性良好、灵敏度较高、稳定性较强。该方法的建立为将来实现对基因编辑产品的有效监测提供了一定的技术支撑。

• 单位
  浙江省农业科学院