科研之友
微信
新浪微博
Facebook
分享链接
摘要
目的 合成多肽CPI-1的N端或C端衍生物并进行活性评价，以获得活性更高、药动学性质更好的A型肉毒毒素(BoNT/A)轻链抑制剂。方法 采用固相方法合成CPI-1 C端增加不同氨基酸的非长链衍生物[CPI-1-L(1),CPI-I-GL(2),CPI-1-W(3),CPI-1-Y(4),CPI-1-R(5),CPI-1-K(6)和CPI-1-E(7)]及C端或N端引入长链脂肪酸的长链衍生物[CPI-1-K(stearic)GG(8),CPI-1-LK(stearic)GG(9),CPI-1-LGK(stearic)GG(10),C8-CPI-1(11),C12-CPI-1(12),C14-CPI-1(13)和C16-CPI-1(14)]。线性肽CPI-1及非长链修饰衍生物完成固相合成后，脱除保护基后在NH4HCO3溶液中氧化折叠成环状目标肽；CPI-1长链修饰衍生物线性肽完成固相合成后，在树脂上直接碘氧化关环，然后裂解。各粗肽经高效液相色谱法(HPLC)纯化后得到目标肽。采用荧光共振能量转移法测定目标多肽对轻链片段LC424的抑制活性，HPLC测定多肽对胰蛋白酶酶解的稳定性。小鼠随机分为毒素组、毒素+CPI-1组及毒素+CPI-1衍生物组，(1)将生理盐水、5 mg·kg-1CPI-1或CPI-1衍生物分别与2×LD50(或2.5×LD50)BoNT/A孵育后ip给予小鼠，测定72 h内小鼠存活率；(2)以2×LD50BoNT/A攻毒2和6 h后，分别给予生理盐水和5 mg·kg-1CPI-1或CPI-1衍生物进行解救，观察72 h内小鼠存活率。结果 共合成14个CPI-1衍生物，其中7个非长链修饰衍生物，7个长链修饰衍生物，经质谱鉴定相对分子质量正确。LC424抑制实验结果表明，CPI-1 C端引入疏水氨基酸亮氨酸(CPI-1-L)、色氨酸(CPI-1-W)、酪氨酸(CPI-1-Y)及碱性氨基酸精氨酸(CPI-1-R)后，其对轻链的抑制活性(IC50=0.06～0.15μmol·L-1)较CPI-1提高3.5～0.8倍(P<0.01)，引入酸性氨基酸谷氨酸(Glu)(CPI-1-E)抑制活性(IC50=1.26±0.28μmol·L-1)降低78.6%(P<0.01);C端或N端引入长链脂肪酸修饰后抑制活性(IC50>1.36μmol·L-1)下降>80%(P<0.01)。酶降解稳定性实验结果表明，C端或N端引入长链脂肪酸修饰后，CPI-1-K(stearic)GG和C12-CPI-1的8 h胰蛋白酶降解率显著降低(P<0.05,P<0.01)。小鼠实验结果表明，2×LD50BoNT/A与CPI非长修饰衍生物共孵育30 min后ip给予小鼠，与毒素组相比，毒素+CPI-1组小鼠72 h内存活率无明显差异；毒素+衍生物CPI-1-L,CPI-1-W,CPI-1-Y,CPI-1-R和CPI-1-K组小鼠72 h内存活率明显提高(P<0.05)，且与毒素+CPI-1组相比也均明显提高(P<0.05);2.5×LD50BoNT/A与CPI长链修饰衍生物共孵育30 min后ip给予小鼠，与毒素组相比，毒素+CPI-1组及毒素+衍生物CPI-1-LK(stearic)GG、C12-CPI-1、C14-CPI-1和C16-CPI-1组小鼠72 h内存活率明显提高(P<0.05)，毒素+衍生物CPI-1-K(stearic)GG,CPI-1-LGK(stearic)GG及C8-CPI-1组无明显差异；与毒素+CPI-1组相比，毒素+衍生物各组均无明显差异。2×LD50BoNT/A攻毒2和6 h后给予CPI衍生物进行解救，与毒素组相比，毒素+C12-CPI组小鼠72 h内存活率明显提高(P<0.05)，毒素+CPI-1及其余衍生物组无明显差异；与毒素+CPI-1相比，毒素+各衍生物组小鼠72 h内存活率均无明显差异。结论 CPI-1 C端引入疏水或碱性氨基酸可提高对轻链的抑制活性，C端脂肪链修饰衍生物抗酶解能力增强，N端月桂酸修饰衍生物在小鼠体内具有明显的抗BoNT/A活性。
-
单位贵州医科大学; 贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室
