科研之友
微信
新浪微博
Facebook
分享链接
摘要
目的研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其细胞转化机制,对HPV16 E5蛋白原核和真核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPV16感染患者子宫颈细胞DNA为模板,采用PCR方法扩增HPV16 E5基因,经 BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切后插入相同酶切的pET32a(+)载体,转染JM109感受态细胞,并进行阳性克隆筛选。经IPTG 对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS-PAGE和Westem blotting检测目标蛋白表达情况。将BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切 pET32(+)／E5质粒后取得的E5全基因片段转入pcDNA3．1(+)空质粒,构建pcDNA3．1(+)／E5真核表达质粒并对NIH3T3 细胞进行转染,最后用G418进行稳定表达株的筛选,并采用RT-PCR鉴定细胞内HPV16 E5基因表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pET32／E5,在1 mmol／L IPTG、28℃诱导条件下BL21(DE3)菌体中HPV16E5-TRX融合蛋白占菌体总蛋白的10％左右。真核表达质粒pcDNA3．1(+)／E5在成功转染NIH3T3细胞后于250μg/ml G418浓度时筛选21 d得到了E5基因稳定表达株,RT-PCR产物测序得到了HPV16 E5基因全序列。结论成功构建了pET32／E5原核和 pcDNA3．1(+)／E5真核表达质粒,HPV16E5蛋白在大肠杆菌和NIH3T3细胞中的稳定表达,这些结果为进一步深入研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用奠定了坚实基础。
- 单位
