p70/p85核糖体蛋白S6激酶1重组真核表达载体的构建及其在人乳腺癌MCF-7细胞内功能的初步鉴定

作者：赵莉; 侯敬申; 白晓春; 贾春宏

来源：中国肿瘤生物治疗杂志, 2014, 21(04): 459-463.

DOI：10.3872/j.issn.1007-385X.2014.04.018

• 核糖体蛋白S6激酶1
• 基因重组
• 载体构建
• 真核表达
• 细胞死亡
• 乳腺癌
• MCF-7细胞

目的:构建p70核糖体蛋白S6激酶1(p70 ribosomal protein S6 kinase 1,p70 S6K1)及p85 S6K1基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-flag-p70 S6K1和pcDNA3.1(-)-flag-p85 S6K1,并鉴定其在人乳腺癌MCF-7细胞内的表达及功能。方法:以pRK7-HA-S6K1为模板,采用PCR扩增出目的基因片段p70 S6K1、p85 S6K1,克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-)-flag构建重组表达载体pcDNA3.1(-)-flag-p70 S6K1和pcDNA3.1(-)-flag-p85 S6K1,采用PCR、双酶切和DNA测序鉴定。将重组载体转染MCF-7细胞,24 h后采用Western blotting方法检测细胞内p70 S6K1、p85 S6K1蛋白的表达;同时向转染细胞内加入1 mmol/L H2O2处理36 h,观察p70 S6K1、p85 S6K1蛋白对H2O2诱导的细胞死亡的影响。结果:成功扩增得到p70 S6K1、p85 S6K1基因片段并构建重组真核表达载体pcDNA3.1(-)-flag-p70 S6K1和pcDNA3.1(-)-flag-p85 S6K1,重组载体经PCR、双酶切鉴定均出现p70 S6K1和p85S6K1预期条带,DNA测序结果显示其全长基因阅读框完整、正确。重组载体在MCF-7细胞中高效表达flag-p70 S6K1和flag-p85S6K1,且p85 S6K1能增强H2O2诱导的细胞死亡。结论:成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1(-)-flag-p70 S6K1和pcDNA3.1(-)-flag-p85 S6K1,均能在MCF-7细胞中高效表达,且p85 S6K1能够增强H2O2诱导的细胞死亡。

• 单位
  广州医科大学附属第二医院; 广州医科大学; 基础医学院; 南方医科大学