CRISPR/Cas13a和MicroRNA介导的牛MSTN基因RNA干扰效率的比较

作者：雷佳茹; 王淞; 狄安琪; 安常所; 孙雪松; 刘明成; 袁宏敏; 杨磊^*; 李光鹏^*

来源：农业生物技术学报, 2023, 1-11.

• RNA干扰(RNAi)
• CRISPR/Cas13a
• 微小RNA (miRNA)
• 肌肉生长抑制素(MSTN)

RNA干扰(RNA interference, RNAi)主要由小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)、短发夹RNA (short hairpin RNA, shRNA)、微小RNA (microRNA, miRNA)和CRISPR/Cas13a介导。miRNA通过与靶标mRNA碱基互补配对介导RNAi。CRISPR/Cas13a通过crRNA (CRISPR-derived RNA)和Cas13a蛋白的共同作用介导RNAi。关于CRISPR/Cas13a和miRNA介导的RNAi效率比较目前尚无报道。本研究根据肌肉生长抑制素基因(myostatin, MSTN)在西门塔尔牛(Bos taurus)和小鼠(Mus musculous)的mRNA同源序列，设计牛和小鼠通用的MSTN-crRNA-1/2/3和MSTN-miRNA-1/2/3。为了排除由Cas13a蛋白表达不稳定引起的CRISPR/Cas13a干扰效率波动，首先制备稳定表达Cas13a蛋白的牛肌肉卫星细胞(satellite cells, SCs)和小鼠成肌细胞系C2C12，将MSTN-crRNA-1/2/3和MSTN-miRNA-1/2/3分别转染牛SCs和小鼠C2C12。转染48 h后，采用qRT-PCR检测CRISPR/Cas13a和miRNA介导的MSTN干扰效率；此外，采用MTT法和细胞增殖检测试剂盒CCK-8 (Cell Counting Kit-8)检测CRISPR/Cas13a和miRNA介导的MSTN基因敲低对牛SCs和小鼠C2C12活力和增殖的影响。结果显示，MSTN-crRNA-1/2/3在牛Cas13a-SCs和小鼠Cas13a-C2C12中的平均干扰效率和最高干扰效率分别为45%和54%,MSTNmiRNA-1/2/3在牛SCs和小鼠C2C12中的平均干扰效率和最高干扰效率分别为30%和33%，说明CRISPR/Cas13a干扰效率高于miRNA;MSTN-miRNA-1/2/3使牛SCs和小鼠C2C12细胞活力和增殖能力分别下降了12%和12.5%(P<0.05)，而MSTN-crRNA-1/2/3对细胞活力和增殖能力没有影响。上述结果说明，基于CRISPR/Cas13a构建的MSTN干扰载体优于miRNA。本研究为模式动物和大家畜的基因编辑研究与应用提供基础资料。

• 单位
  内蒙古大学