基于萤火虫荧光素酶报告基因检测凋亡的系统构建及鉴定

作者：车路平; 栗永华; 杨斌; 徐智凯; 廖瑛; 仇旭升; 谭磊; 孙英杰; 宋翠萍; 丁铲; 姚刚; 王金泉^*; 孟春春^*

来源：生物工程学报, 2019, 35(08): 1557-1565.

DOI：10.13345/j.cjb.180276

• 萤火虫荧光素酶
• 凋亡
• Caspase-3

为构建一个能够快速检测凋亡的含荧光素酶报告基因(Fluc)的真核表达质粒,采用PCR的方法将Caspase-3的识别基序Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)四个氨基酸引入至Fluc基因的C端和N端之间;同时选取Asp-Glu-Val-Gly (DEVG)四个氨基酸作为阴性对照。随后重组片段分别克隆至分离型内含肽的N端和C端之间,并命名为pFluc-DEVD和pFluc-DEVG。将该表达质粒与海肾荧光素酶报告质粒(RLUC)同时转染至HeLa细胞,通过双荧光素酶报告基因和Western blotting实验检测细胞凋亡水平。双荧光素酶报告基因系统实验结果显示,当发生凋亡时,pFluc-DEVD质粒组表达的萤火虫荧光素酶的含量高出pFluc-DEVG质粒组约3倍。Western blotting检测结果显示,转染pFluc-DEVD质粒的细胞在凋亡药物刺激后,Fluc活化的蛋白显著增多,且Caspase-3的活化程度与Fluc的表达呈正相关,并有显著的统计学差异。以上结果表明,pFluc-DEVD真核表达质粒表达的萤火虫荧光素酶蛋白能被细胞内的Caspase-3酶裂解,且该质粒能够精确地反映出细胞的凋亡水平,为后续进行凋亡定量检测提供了一个可借鉴的方法。

• 单位
  新疆农业大学; 中国农业科学院上海兽医研究所