沉默调节蛋白6-谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白的克隆表达

作者：夏天; 刘建湘; 姚景宏; 吴太鼎; 刘子建; 杨述华

来源：中华实验外科杂志, 2012, 29(02): 318-320.

DOI：10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2012.02.054

• 沉默调节蛋白6
• 谷胱甘肽-S-转移酶
• 融合蛋白
• 纯化

目的构建含有人沉默调节蛋白6(hSIRT6)基因的重组原核表达载体,获得高效表达hSIRT6蛋白的基因工程菌,以及较高产量的SIRT6蛋白。方法取205 ng HEK293细胞总RNA逆转录后合成的cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增hSIRT6的编码序列,并克隆至原核表达载体pGEX-4T-3中,构建重组的质粒pGEX4T-3/SIRT6;将重组质粒pGEX4T-3/SIRT6转化感受态细菌BL21(DE3),在含100 mg/L氨苄西林的LB平板37℃培养过夜,以pGEX4T-3空载体作为对照,在相同条件下转化并异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶(GST)蛋白。产物经SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定。结果 PCR产物大小及双酶切鉴定证明所克隆的基因是hSIRT6,DNA测序进一步证实与GeneBank序列完全一致。获得高表达及纯化的SIRT6-GST融合蛋白,该可溶蛋白的相对分子质量为72×10~3,经Western blot鉴定证实为目的蛋白。结论成功构建了基因重组体pGEX-4T-3/hSIRT6,并制备出可溶性SIRT6-GST融合蛋白。

• 单位
  华中科技大学同济医学院附属协和医院