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摘要
背景：进行一些以心肌细胞学为基础的检测技术，首先必需采用心肌细胞分离方法提取心肌细胞，由于使用器械的限制或分离方法的缺陷，往往提取不到足够数量和高质量的心肌细胞。采用超低温液氮保存的成年大鼠心室肌细胞分离法是解决这一技术问题有效的方法之一。 目的：探讨成年大鼠心室肌细胞超低温液氮保存分离法制备心肌细胞悬液的可行性。 设计：以实验动物为观察对象的心室肌细胞分离方法。 单位：广州中医药大学第一附属医院心内科和广州医学院第二附属医院中医科。 材料：实验于2001-10／2002-04在广州中医药大学第一附属医院内科实验室及细胞分子生物技术实验室完成。选用200～220g SD大鼠30只；Krebs-Henseleit缓冲液(pH7．4)：NaCl 118mmol，L，KCl4．8mmol／L，MgSO_41．2mmol／L，KH_2PO_4 1．2 mmol／L，NaHCO_3 25 mmol／L，Glucose 11 mmol／L。 方法：麻醉大鼠开胸后，迅速取出心脏，置于冷Krebs-Henseleit液中，洗去残存的血液，弃去大血管、心房和右心室，将左心室肌剪成两块，然后置于含600mL／L甘油的DMEM的冻存管中，程序冷冻，即4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，最后保存于-196℃的液氮中备用。分离心肌细胞时，从液氮中取出冻存的左心室肌，迅速放入40℃水浴中解冻；用DMEM清洗心脏；将左心室肌剪碎成1mm~3的小块，于冷Krebs-Henseleit液中吹打10min，以分离心室肌细胞；将含心肌细胞的悬液用100目网筛过滤，800r／min，离心5min。弃上清，0．1mol／L磷酸盐缓冲液清洗沉淀2次，800r／min离心5min；必要时可再次吹打左心室肌碎片以获得更多的左心室肌细胞；将沉淀轻轻加入40g／L的Ficoll上，400r／min离心4min，弃上清，沉淀即为高纯度的杆状的心肌细胞。 主要观察指标：是否分离出高纯度的符合质量的心肌细胞。 结果：采用成年大鼠心室肌细胞超低温液氮保存分离法，成功地分离出足够数量符合质量的杆状心肌细胞。 结论：运用液氮冻存的大鼠心室肌来分离心室肌细胞的方法是可行的，可作为以细胞学为基础一些分子生物学甚至基因组学、蛋白组学研究中的一种最基本的实验方法。该方法具有无需特殊昂贵设备、简单易行、消耗低廉、耗时短、适于大样本研究。
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单位广州医学院第二附属医院; 广州中医药大学第一附属医院
