MGMT基因siRNA质粒载体的构建及鉴定

作者：高薇; 王中; 周岱; 虞正权

来源：中国血液流变学杂志, 2010, 20(3): 360-363.

DOI：10.3969/j.issn.1009-881X.2010.03.004

• 胶质瘤
• MGMT基因(O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶)
• siRNA
• 载体构建

目的 构建MGMT基因的siRNA(small interfering RNA)质粒载体pRNAT-H1.1/Neo-MGMT siRNA,为进一步研究siRNA对MGMT基因的抑制作用,探讨MGMT在胶质瘤的化疗耐药及逆转胶质瘤细胞耐药表型中的作用奠定基础.方法 针对MGMT的靶序列设计合成二三条shRNA(small hair RNA)的DNA模板单链,同时模板链两端分别设计BamHⅠ和Hind Ⅲ限制酶切位点.退火形成siRNA载体插入片断.用限制性内切酶将pRNAT-H1.1/Neo线性化,T4连接酶将插入片断插入pRNAT-H1.1/Neo中.重组质粒转化大肠杆菌DH5α后培养出阳性克隆,抽提质粒,经酶切、电泳和测序的方法鉴定质粒构建是否成功.结果 设计构建三条针对MGMT基因的siRNA质粒载体,经双酶切,在2%琼脂糖凝胶电泳结果显示:PCR产物大小76bp,产物大小与设计的完全相同.测序结果证明序列正确.结论 成功设计构建了三条针对MGMT基因的siRNA质粒载体,为研究RNA干扰逆转胶质瘤细胞的耐药表型提供了良好的实验材料.

• 单位
  苏州大学附属第一医院