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摘要
目的探讨应用一步反转录PCR(RT-PCR)技术检测4种人疟原虫的可行性和特异性。方法取恶性疟(1例)、间日疟(1例)、卵形疟(1例)和三日疟(5例)患者全血,提取疟原虫总RNA和基因组DNA。应用一步RT-PCR和一步实时荧光RT-PCR分别扩增经脱氧核糖核酸酶(DNase)消化的疟原虫RNA样品中的18S rRNA序列,应用普通PCR和一步RT-PCR技术分别扩增不同稀释浓度的疟原虫RNA(未经DNase消化和经DNase消化)和DNA样品中的疟原虫18S rRNA序列和18S r DNA序列,比较2种检测技术可检测到目标序列的样品最低稀释浓度。结果患者全血基因组DNA经一步RT-PCR分别扩增出310、394和323 bp条带,测序结果显示分别为恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、卵形疟原虫(P.ovale)和间日疟原虫(P.vivax)的18S rRNA序列特异性条带,但未扩增出三日疟原虫(P.malariare)特异条带。一步实时荧光RT-PCR结果显示,4种人疟原虫RNA样品均出现相应的荧光信号,除三日疟原虫样品外,各溶解曲线均仅有单一的扩增峰。因4种人疟原虫DNA和RNA原液样品中模板量的差异,一步RT-PCR可检测到的最低稀释浓度从1至10-4不等,但可检测到的DNA样品的最低稀释浓度与未经DNase消化的RNA样品相同或较后者低一个数量级,且两者最低稀释浓度均低于经DNase消化的RNA样品。与普通PCR的检测结果比较发现,同一样品均以一步RT-PCR可检测到的稀释浓度最低,较普通PCR的敏感性提高10～1 000倍。结论一步RT-PCR技术可检测出人血液样品中的恶性疟原虫、卵形疟原虫和间日疟原虫DNA,但在检测三日疟原虫样品中的适用性有待进一步分析。
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单位安徽省疾病预防控制中心; 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所; 卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室; 上海市疾病预防控制中心
