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摘要
旨在为表达牛冠状病毒（bovine coronavirus，BCoV）的纤突蛋白（S蛋白），并评价其作为免疫原免疫小鼠后的免疫效果。本研究以BCoV/SUWN/HXD-4/2021株的全长S基因为模板，针对昆虫细胞进行密码子优化和合成，构建重组质粒pFastBac-Dual-S，与DH10Bac同源重组后转染昆虫细胞收获重组杆状病毒rpFastBac-S，利用基因组PCR、免疫印迹法（Western blot）和间接免疫荧光试验对其进行鉴定，测定杆状病毒滴度。优化和筛选感染剂量对蛋白表达的影响，超速离心纯化蛋白，免疫小鼠和评估其免疫效果。结果显示：优化后全长4 108 bp的BCoV S基因CAI（密码子适应指数）从0.39调整为0.87，平均GC含量从35.8%调整为50.6%。经双酶切、PCR验证，重组质粒与重组杆粒均构建成功。用5 μg重组杆粒Bacmid-S转染Sf9细胞并传代至第四代后细胞病变趋于稳定，感染杆状病毒约20 h后产生典型病变，收获重组杆状病毒进行鉴定。PCR电泳结果显示重组杆粒携带S目的蛋白基因；间接免疫荧光试验显示，试验组观察到特异性绿色荧光；Western blot结果显示重组杆状病毒rpFastBac-S所表达的蛋白为S目的蛋白，目的条带位于250 ku左右，感染剂量MOI=0.5时蛋白表达量最高。将50 μg蛋白、20 μg CpG免疫增强剂与等体积MF59佐剂充分混合乳化后，肌肉注射免疫小鼠，间接ELISA试验结果显示，小鼠免疫蛋白后产生了IgG特异性抗体，且抗体水平高于佐剂对照组(P<0.001)，最高抗体效价达1:12 800；微量中和实验结果显示，小鼠血清中和效价最高达1:224，试验组中和效价平均值高于灭活病毒组，但统计学差异不显著（P>0.05）。本研究利用杆状病毒表达系统表达了牛冠状病毒S蛋白，并对S蛋白免疫保护效果做了进一步评价，为后续牛冠状病毒疫苗研究提供了理论依据。
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