泛素E3连接酶CHIP和E4B互换U-box结构域突变体的构建及泛素化活性验证

作者：范宇宸; 陆瑶; 刘香男; 赵博^*

来源：生物技术通报, 2021, 37(12): 191-197.

DOI：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0230

• 泛素E3连接酶CHIP
• 泛素E3连接酶E4B
• 突变体
• U-box结构域
• 底物

旨在构建互换U-box结构域的泛素E3连接酶CHIP和E4B的突变体,用以研究U-box结构域对两种U-box家族泛素E3连接酶CHIP和E4B活性的影响。通过overlap PCR的方法构建CHIP U-box替换为E4B U-box的突变体C+E,以及E4B U-box替换为CHIP U-box的突变体E+C。将突变体质粒分别与CHIP底物RCC2、E4B底物NIPSNAP1、CHIP和E4B共同底物p53、CDC37质粒共转染至HEK-293T细胞。Western Blot检测底物和CHIP、E4B及其突变体表达情况,免疫共沉淀法检测底物的泛素化水平。结果显示,成功构建了两种泛素连接酶互换U-box结构域的突变体,且两种突变体在HEK-293T细胞中均能表达。两种突变体均部分保留了泛素化各自底物的活性,C+E能够泛素化共同底物p53和CDC37。

• 单位
  上海交通大学