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摘要
目的死亡效应结构域DNA结合蛋白(death effector domain DNA-binging protein,DEDD)可抑制乳腺癌的生长和转移,但在乳腺癌多药耐药中的作用尚不明确。本研究将探讨DEDD在人乳腺癌多药耐药中的作用及机制。方法通过转染DEDD-shRNA建立稳定敲低DEDD表达的MCF-7人乳腺癌细胞株,MTS实验检测多柔比星、紫杉醇对MCF-7WT(Wild type,野生型)、MCF-7control shRNA和MCF-7DEDD-shRNA细胞活力的影响,Annexin-V和碘化丙啶(propidium iodide,PI)双染后流式细胞仪检测细胞凋亡。蛋白质印迹法检测乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein,BCRP)在药物干预后的蛋白表达水平。结果多柔比星干预后,半数抑制浓度IC50的多因素方差分析结果显示,不同处理(F=89.49,P<0.001)、不同时间(F=50.81,P<0.001)组间比较差异有统计学意义。多柔比星干预24或48h后,MCF-7DEDD-shRNA的半数抑制浓度IC50分别为(0.97±0.15)和(0.62±0.09)μmol/L,明显高于MCF-7 WT(0.46±0.05)和(0.26±0.03)μmol/L和MCF-7control shRNA细胞(0.39±0.05)和(0.25±0.03)μmol/L,P<0.001。紫杉醇干预后,半数抑制浓度IC50的多因素方差分析结果显示,不同处理(F=15.94,P<0.001)、不同时间组间(F=129.70,P<0.001)比较差异有统计学意义。紫杉醇干预24或48h后,MCF-7DEDD-shRNA的半数抑制浓度IC50为(16.74±2.26)和(9.88±1.47)μmol/L,明显高于MCF-7 WT(13.39±1.44)和(7.69±0.92)μmol/L(P=0.001)和MCF-7control shRNA细胞(12.58±1.15)和(7.17±1.12)μmol/L(P<0.001)。多柔比星干预后24h后流式细胞凋亡结果显示,不同处理(F=131.46,P<0.001)、不同浓度组间(F=160.95,P<0.001)比较差异有统计学意义。正常培养状态下,MCF-7control shRNA细胞和MCF-7DEDD-shRNA细胞的凋亡率分别为(14.32±1.47)%和(11.58±1.63)%,而给予0.5μmol/L和1μmol/L多柔比星作用24h后,MCF-7DEDD-shRNA细胞的凋亡率分别为(21.62±1.97)%和(24.39±2.36)%,明显低于MCF-7control shRNA细的(36.26±1.87)%和(38.23±1.46)%,P<0.001。同样,紫杉醇干预后24h,不同处理(F=124.81,P<0.001)、不同浓度组间(F=172.56,P<0.001)细胞凋亡率比较差异有统计学意义。给予9.37和18.74μmol/L紫杉醇作用24h后,MCF-7DEDD-shRNA细胞的凋亡率分别为(30.26±1.63)%和(32.18±2.16)%,明显低于MCF-7control shRNA组的(53.84±2.17)%和(58.27±2.16)%,P<0.001。多柔比星作用后不同时间BCRP蛋白质印迹检测统计分析结果显示,不同处理(F=14.67,P<0.001)、不同时间(F=6.39,P=0.006)组间BCRP蛋白表达比较差异有统计学意义。给予0.5μmol/L多柔比星作用24h后,3组细胞的BCRP相对表达水平分别为0.87±0.04、1.06±0.02和5.25±0.18。MCF-7DEDD-shRNA细胞组BCRP蛋白的表达水平显著高于MCF-7 WT和MCF-7control shRNA细胞组,P<0.001。多柔比星作用48h后,3组细胞的BCRP相对表达水平分别为1.06±0.01、0.97±0.04和2.98±0.13。MCF-7DEDD-shRNA细胞组BCRP蛋白的表达水平出现回落,但仍显著高于MCF-7WT和MCF-7control shRNA细胞组,P<0.001。同样,紫杉醇作用后不同时间BCRP蛋白质印迹检测统计分析结果显示,不同处理(F=7.26,P=0.004)、不同时间(F=8.32,P=0.002)组间BCRP蛋白表达比较差异有统计学意义。给予9.37μmol/L紫杉醇作用24h后,3组细胞的BCRP相对表达水平分别为0.81±0.05、2.25±0.10和1.78±0.14。其中MCF-7control shRNA组细胞BCRP表达水平高于MCF-7WT(P<0.001)和MCF-7DEDD-shRNA(P=0.002)组。而紫杉醇作用48h后,3组细胞的BCRP相对表达水平分别为0.73±0.04、1.73±0.05和3.12±0.12,MCF-7DEDD-shRNA细胞组BCRP蛋白的表达水平继续增高,且显著高于MCF-7WT和MCF-7control shRNA细胞组,P<0.001。结论敲低DEDD表达可增强乳腺癌细胞的抗肿瘤药耐药性,BCRP的表达增加可能是低表达DEDD乳腺癌细胞多药耐药的机制之一。
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单位中心实验室; 武警后勤学院
