摘要

为了阐明鱼类TANK结合激酶1(TBK1)在免疫应答密切相关的NF-κB、I型IFN及MAPK信号通路中的调控作用,本实验通过cDNA末端快速扩增技术(SMARTRACE)从日本鳗鲡中克隆了TBK1基因cDNA全长序列,命名为AjTBK1,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测了在体和离体状态下不同病原体相关分子模式(PAMPs)及嗜水气单胞菌对日本鳗鲡AjTBK1基因表达水平变化的影响,通过构建绿色荧光蛋白pEGFP-TBK1和pCMV-TBK1真核表达质粒对AjTBK1亚细胞定位以及AjTBK1过表达对NF-κB、AP-1、IFN-β启动子荧光素酶活性的激活作用进行研究。蛋白质序列分析显示,日本鳗鲡AjTBK1编码731个氨基酸,其三维丝带空间结构与人类TBK1相似,具有保守的激酶结构域(KD)、泛素样结构域(ULD)、二聚化支架结构域(SDD)以及C端结构域(CTD),在系统发育树中与其他鱼类TBK1家族聚为一支。qRT-PCR检测发现AjTBK1在多种组织中广泛表达,且在肝脏和肠中高表达。经LPS、poly I:C、嗜水气单胞菌免疫注射后,AjTBK1基因表达水平在日本鳗鲡肝脏中显著提高,而肾脏中的表达量则在LPS和poly I:C刺激后显著降低。离体实验中,经LPS、poly I:C、PGN以及不同浓度嗜水气单胞菌刺激后的日本鳗鲡肝脏细胞AjTBK1基因表达水平均有显著升高。亚细胞定位结果显示天然状态下的AjTBK1在HEK293细胞质中分布,经LPS和poly I:C刺激后呈聚集点状分布。此外,双荧光素酶活性检测发现过表达的AjTBK1可显著增强NF-κB、AP-1和IFN-β启动子荧光素酶活性。以上研究表明AjTBK1可以通过激活NF-κB、AP-1和I型IFN信号通路,在机体抗细菌和抗病毒先天免疫应答中发挥重要的调控作用。