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摘要
目的构建人源性Rab32荧光融合蛋白表达载体p EGFP-Rab32,并观察Rab32在人黑素细胞瘤细胞系A375中细胞定位情况。方法收集并提取A375细胞中的总RNA,反转录成c DNA,以特异性引物扩增Rab32片段,经Xho I和Kpn I双酶切聚合酶链反应(PCR)产物和p EGFP-C3表达载体,酶切产物经胶回收、连接后转化至感受态大肠杆菌DH5a中,挑取单克隆菌落进行菌液PCR鉴定、酶切鉴定和测序分析,以确定表达载体构建正确。将构建的重组质粒转染A375细胞,Western blot检测细胞中Rab32表达水平,激光共聚焦显微镜观察其细胞定位。结果p EGFP-Rab32重组质粒经菌落PCR、双酶切和测序鉴定构建正确,转染A375细胞后,Western blot可检测出细胞中p EGFP-Rab32融合蛋白的表达,激光共聚焦显微镜观察到Rab32定位于细胞质中,且大量聚集于细胞核周围。结论p EGFP-Rab32融合蛋白表达载体成功构建,并观察了Rab32在细胞中的定位,为进一步研究Rab32在黑素代谢中的作用奠定了良好的基础。
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