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摘要
为提高牛奶中大肠杆菌的检测效率，简化分析流程，该文建立基于成簇的规则间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）的牛奶中大肠杆菌快速检测体系。首先，构建CRISPR相关蛋白（CRISPR-associated protein,CRISPR-Cas）,CRISPR-Cas12a的重组表达质粒，并将其转化至BL21感受态细胞，利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（lsopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG）诱导表达Cas12a蛋白。然后，通过麦芽糖结合蛋白（maltose binding protein,MBP）亲和层析、凝胶过滤层析等方法将Cas12a蛋白进行纯化。最后，设计靶向大肠杆菌16S rDNA目的片段的特异性CRISPR RNA (crRNA)，将特异性的crRNA、大肠杆菌16S rDNA的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）胶纯化产物和纯化的Cas12a蛋白进行混合，建立CRISPR-Cas12a靶向切割体系。验证结果显示该体系可用于检测牛奶样品中的大肠杆菌。
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