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摘要
目的 为深入研究结核分枝杆菌Rv2779c基因的功能，构建针对该基因的敲除突变菌株。方法 以结核分枝杆菌H37Rv标准菌株基因组DNA为模板，PCR扩增Rv2779c基因上下游大约500 bp左右的片段作为同源重组的左右臂，并将同源重组左右臂构建到p0004s穿梭质粒上，将p0004s同源重组质粒构建到phAE159质粒中形成噬菌粒，包装形成的噬菌体侵染H37Rv后将同源重组元件整合到基因组中，通过重组元件中的潮霉素抗性标记对阳性克隆进行筛选，同时利用左右臂扩增及内部片段扩增的原理，对抗性筛选阳性克隆进行鉴定。比较Rv2779c基因敲除突变株与H37Rv标准菌株在正常7H9完全培养基及含高浓度利福平培养基中的生长差异。结果 成功构建了包含Rv2779c上下游序列同源重组臂的p0004s-ΔRv2779c重组质粒，并将该质粒与含有分枝杆菌温度敏感型元件的phAE159质粒连接获得重组噬菌粒，最后将包装成功的噬菌体侵染H37Rv获得抗性筛选阳性的克隆菌株，PCR表明结核分枝杆菌Rv2779c基因敲除成功。Rv2779c基因敲除对结核分枝杆菌在正常培养基中生长几乎没有影响，但显著降低了结核分枝杆菌在高浓度利福平培养基中的存活率。结论 首次成功构建了结核分枝杆菌Rv2779c敲除菌株，为后续进一步研究Rv2779c基因的功能奠定了重要基础。初步研究发现该基因影响结核分枝杆菌在含利福平培养基中的持留生长。
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单位北京市结核病胸部肿瘤研究所; 首都医科大学附属北京胸科医院
