粪便具核梭杆菌的免疫磁珠捕获联合实时荧光定量PCR检测方法的建立及评价

作者：顿国栋; 童亚楠; 卢晓雪; 冯宇阳; 叶新力; 李静; 唐彬; 邓铃; 何晓奕; 李倩; 毛旭虎

来源：免疫学杂志, 2019, 35(09): 811-816+822.

DOI：10.13431/j.cnki.immunol.j.20190127

• 具核梭杆菌
• 结直肠癌
• 免疫磁珠
• qPCR

目的建立定量检测粪便中具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,F. nucleatum)的免疫磁珠捕获联合实时荧光定量PCR(IMBs-qPCR)技术方法。方法 5×10～8CFU F. nucleatum(0.4%甲醛灭活)免疫新西兰兔制备多克隆抗体,饱和硫酸铵沉淀法和Hi Trap Protein G HP亲和层析法纯化抗体;优化MS 300免疫磁珠偶联多克隆抗体和捕获F. nucleatum的反应条件。根据F. nucleatum特异性基因NusG设计引物和构建含目的基因的载体质粒,建立qPCR反应体系并绘制qPCR标准曲线。最后,在不同浓度(50 CFU/200 mg～10～5CFU/200 mg)F. nucleatum的人粪便标本中,评价该方法的检测效能。结果成功制备F. nucleatum多克隆抗体,抗体ELISA效价>320 000,盐析和亲和层析纯化抗体纯度分别为60%和85%;多克隆抗体偶联免疫磁珠时偶联缓冲液最佳pH值为5.0,最佳温度为25℃,最佳偶联时间为2.5 h,加入抗体最适量为10μg/mg,免疫磁珠最佳捕获温度为37℃,时间为40 min;成功建立qPCR反应体系;IMBs-qPCR和粪便全基因组DNA提取法直接检测模拟粪便标本最低检测限分别为100 CFU/200 mg和400 CFU/200 mg,ROC曲线中AUC分别为0.948和0.878。结论成功建立了IMBs-qPCR检测粪便中F.nucleatum的方法,该方法具有简便快速、灵敏度高、特异性好等特点。

• 单位
  中国人民解放军陆军军医大学; 重庆医科大学