海南岛淡水鱼类eDNA宏条形码COI通用引物的筛选

作者：陈治; 蔡杏伟^*; 申志新; 张清凤; 李芳远; 谷圆; 李高俊; 赵光军; 王镇江

来源：渔业科学进展, 2023, 1-22.

DOI：10.19663/j.issn2095-9869.20221107001

• 海南岛
• 淡水鱼类
• eDNA
• COI
• 通用引物

已知的鱼类环境DNA (environmental DNA， eDNA)宏条形码通用引物主要位于线粒体核糖体基因区，这些12S和16S引物存在部分近缘鱼类无法识别及参考序列不足等问题。本研究以海南岛淡水鱼类为调查对象：基于8目26科101属150种鱼类COI序列，筛选出6个侧翼保守区；综合碱基变异、物种鉴定、eDNA降解及高通量测序读长需求，在4个侧翼保守区设计了26条引物，其中6条引物未达到Premier评分要求；72种海南淡水鱼类的首轮PCR结果显示，有11条引物的通用性较高，其中PCR成功种数≥70且条带亮度均大于marker的引物有5条；次轮PCR结果显示，5条引物相互搭配产生的3 (正向) × 2 (反向)套引物组合的扩增成功率均为100% (72种/72种)，经PCR条带长度、亮度筛选后表现最优的引物组合为“HN-A-F4、HN-D-R3”(以下简称HN-COI)。30个水样高通量测序结果显示，HN-COI产生的待分析序列总数、鱼类序列总数、OTUs总数和鱼类OTUs总数分别为MiFish-U的0.77倍(8 919 976/11 532 126)、1.22倍(2 264 965/1 863 905)、0.85倍(406/477)和1.32倍(86/65)；HN-COI产生的鱼类OTUs注释到种、属、科及科以上水平的占比分别为81.40%、11.63%和6.98%，MiFish-U则分别为81.54%、4.62%和13.85%。“引物+水样”的NMDS聚类图形成边界明显的2组(胁强系数=0.15)；HN-COI的属内物种扩增子两两遗传距离最小值及平均值均分别是MiFish-U的1.23倍(0.006 9/0.005 6)和1.57倍(0.155 9/0.099 4)。室内6个密度组鲤鱼(Cyprinus carpio carpio)“生物量–拷贝数”线性回归方程的相关系数较低，HN-COI及MiFish-U均无法准确反映鲤鱼的生物量。本研究筛选并比较了HN-COI与MiFish-U的优劣，表明HN-COI对海南岛淡水鱼类具有更高的靶向性，不仅在防止微生物、哺乳类等非目标生物eDNA污染方面有优势，而且更有利于海南岛淡水鱼类的检出和准确鉴定。

• 单位
  海南热带海洋学院; 海南省海洋与渔业科学院