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摘要
目的探讨自噬相关基因在博来霉素诱导的小鼠皮肤纤维化中的表达及作用。方法 (1)取72只6周龄雄性BALB/c小鼠,采用随机数字表法分为空白对照组、单纯磷酸盐缓冲液(PBS)组和博来霉素组,每组24只。空白对照组小鼠不予任何处理;单纯PBS组和博来霉素组小鼠背部皮肤分别皮下注射100 μL PBS、博来霉素(1 mg/mL),每天1次,连续注射28 d。注射7、14、21、28 d,每组分别取6只小鼠,肉眼观察小鼠背部皮肤变化,观察结束后处死小鼠,取背部皮肤组织。取注射28 d皮肤组织,行常规苏木精-伊红染色,测量皮肤组织厚度;Masson染色行皮肤组织形态学观察。取注射7、14、21、28 d皮肤组织,酶联免疫吸附测定法检测羟脯氨酸含量,实时荧光定量反转录PCR法和蛋白质印迹法分别检测p62、微管相关蛋白1轻链3 Ⅱ(LC3 Ⅱ)和Beclin-1的mRNA和蛋白表达。(2)取实验(1)中空白对照组小鼠皮肤组织,收集第3～6代成纤维细胞(Fb),采用随机数字表法分为空白对照组、单纯PBS组、博来霉素组,每组6孔。空白对照组细胞不予任何刺激,单纯PBS组、博来霉素组细胞分别加入20 μL PBS、博来霉素(1 mg/mL)刺激72 h,细胞免疫荧光染色观察LC3 Ⅱ的表达。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、t检验及Bonferroni校正。结果 (1)空白对照组和单纯PBS组小鼠注射7、14、21、28 d背部皮肤菲薄、红润、静脉血管清晰,单纯PBS组从注射14 d起穿刺部位可见数个隆起的皮丘。博来霉素组小鼠注射7 d皮肤红润,穿刺点处可见数个隆起的皮丘;注射14 d,皮肤轻微变白;注射21 d,皮肤明显变白,周围血管不清晰;注射28 d,皮肤变白,周围血管无法辨认。(2)注射28 d,空白对照组与单纯PBS组小鼠皮肤组织厚度相近(t=0.79,P>0.05),博来霉素组小鼠皮肤组织厚度较空白对照组和单纯PBS组明显增加(t=0.50、0.50,P<0.01)。(3)注射28 d,空白对照组与单纯PBS组小鼠皮肤组织结构相似,均可见少量胶原,胶原排列整齐有序,毛囊分布均匀;博来霉素组小鼠皮肤胶原数目显著增多,但排列杂乱无序,毛囊数明显减少。(4)注射7、14、21、28 d,博来霉素组小鼠皮肤组织中羟脯氨酸含量明显高于空白对照组、单纯PBS组(t=0.99、0.98、0.50、0.51,0.50、0.50、0.52、0.51,P<0.05或P<0.01)。(5)注射7 d,博来霉素组小鼠皮肤组织p62的mRNA表达明显低于单纯PBS组(t=0.93,P<0.05)。注射14、21 d,博来霉素组小鼠皮肤组织p62、LC3 Ⅱ、Beclin-1的mRNA表达明显高于空白对照组(t=0.74、0.70、0.58,0.49、0.51、0.74,P<0.05)和单纯PBS组(t=0.94、0.65、0.65,0.77、0.49、0.51,P<0.05)。注射28 d,博来霉素组小鼠皮肤组织p62、Beclin-1的mRNA表达明显低于空白对照组(t=0.50、0.44,P<0.05)和单纯PBS组(t=0.97、0.55,P<0.05),而LC3 Ⅱ的mRNA表达仍显著高于空白对照组和单纯PBS组(t=0.51、0.98,P<0.01)。(6)注射7、14、21、28 d,空白对照组、单纯PBS组、博来霉素组小鼠皮肤组织LC3 Ⅱ的蛋白表达为0.167±0.042、0.122±0.016、0.553±0.078、0.118±0.035,0.120±0.023、0.117±0.061、0.581±0.039、0.159±0.065,0.233±0.027、0.304±0.031、1.020±0.010、0.089±0.045。注射14 d,博来霉素组小鼠皮肤组织p62和Beclin-1的蛋白表达明显高于空白对照组(t=0.86、0.89,P<0.05)和单纯PBS组(t=0.42、0.89,P<0.05)。注射21 d,博来霉素组小鼠皮肤组织p62、LC3 Ⅱ和Beclin-1的蛋白表达明显高于空白对照组和单纯PBS组(t=0.82、0.45、0.50,0.79、0.51、0.50,P<0.01)。注射28 d,博来霉素组小鼠皮肤组织p62、LC3 Ⅱ和Beclin-1的蛋白表达明显低于空白对照组和单纯PBS组(t=0.77、0.54、0.52,0.50、0.51、0.50,P<0.05)。(7)培养72 h,博来霉素组Fb中LC3 Ⅱ的表达明显低于空白对照组、单纯PBS组。结论博来霉素刺激皮肤纤维化过程中,自噬相关基因先升高后降低,自噬过程被激活,有望逆转皮肤纤维化进程。
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