筛查氧化还原酶辅因子偏好性相关的突变热点

作者：刘玉雪; 王磊; 王雪颖; 郭潇佳; 赵宗保

来源：中国化学会第30届学术年会-第二十八分会：化学生物学, 中国辽宁大连, 2016-07-01.

• 生物正交体系
• 氧化还原酶
• 亚磷酸脱氢酶
• 非天然辅酶
• 突变热点

构建非天然辅酶依赖型氧化还原体系,可以为复杂代谢网络提供一种选择性调控氧化还原代谢的新工具。进化筛选对非天然辅酶特异的氧化还原酶,是构建生物正交体系的关键。通常在氧化还原酶的辅酶结合结构域Rossmann fold中选择相关氨基酸残基作为突变位点,所获得的突变型酶在催化活性和辅酶特异性方面尚不能满足需求,亟需建立快速筛查突变热点的方法。本研究结合同源建模、半理性设计和单位点饱和突变技术,设计"热点快速筛查"策略用于高效筛选不同氨基酸位点。利用该策略定向改造亚磷酸脱氢酶(PDH),筛选2790个转化子,完成了对15个位点的筛查,筛选完整度达到99.7%,得到的I151R/P176R和I151R/M207A两种PDH突变体,对非天然辅酶烟酰胺胞嘧啶二核苷酸(NCD)的特异性和催化活性显著提高。通过筛选P176和M207的组合突变文库,获得了对NCD特异性提高5700倍的PDH突变体,为正交体系中NCDH高效再生奠定了基础。本工作对构建其它NCD特异性氧化还原酶具有重要参考价值。

• 单位
  中国科学院大连化学物理研究所