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摘要
右旋糖酐蔗糖酶（Dextransucrase,DSR）是一种由肠膜状明串珠菌和口腔链球菌产生的葡萄糖基转移酶,该酶属于糖苷水解酶第70家族（Family 70）,是葡聚糖蔗糖酶领域中研究较早较热门的一类酶。DSR以蔗糖为底物,将蔗糖分子中D一葡萄糖基催化转移到受体分子,用于合成长链右旋糖酐。本研究构建筛选得到具有较高转糖基活性并能够合成短链低聚糖（3-5个糖基）的DSR突变酶,揭示了其合成长链右旋糖酐的关键区域。通过删除C-末端的1494bp片段构建了截短突变体DSR-S1-△A（残基1-3087bp）,该突变体与使用蔗糖为糖基供体和受体合成长链右旋糖酐的野生型DSR不同,当蔗糖被用作唯一底物时,DSR-S1-△A（MW:110kDa）不表达活性。添加其它糖基受体后,DSR-S1-△A能够合成短链寡糖。通过对酶学性质的研究发现:该酶最适pH均为5.4,在pH为4.4-7范围内稳定;最适温度均为25℃;DSR-S1-△A酶在没有受体情况下,酶活完全丧失;受体存在时,DSR-S1-△A酶活是原始酶酶活的71.4%,其中糖基转移活性是水解活性的5.3倍,DSR-S1-△A耐热性与原始酶相比有所下降,在30℃保藏1 h酶活力剩余20.8%。以麦芽糖为受体研究表明,受体浓度为200 mM时酶活最高。供体蔗糖对DSR-S1-△A酶的影响较大,酶活随着蔗糖浓度提高而增加。结果显示DSR-S1-△A主要活性为转糖基功能,多糖聚合能力较低,进而明确了合成长链右旋糖酐的关键区域位于C-末端。最后通过对麦芽糖、纤维二糖、棉子糖和水苏糖等不同糖类受体的转糖基研究的结果表明:DSR-S1-△A对麦芽糖、纤维二糖、棉子三糖和水苏糖都有转糖基活性,麦芽糖是该酶转糖基反应的最佳受体,;不同天然低聚糖的转糖基反应都趋向于生成低分子量的糖,转移1-2个葡萄糖基到受体分子,并且受体分子量越小越易进行转糖基作用,α键连接糖类化合物比β键连接糖类化合物更易进行转糖基反应;说明改造后的酶能利用较少的麦芽糖合成更多的低聚糖。综上,本研究明确了右旋糖酐蔗糖酶转糖基功能的分子区域,有助于进一步认识右旋糖酐蔗糖酶的催化机制;同时对于功能低聚糖的制备和天然产物的糖基化研究具有重要意义。
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