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摘要
【目的】Doublesex属于DMRT基因家族成员之一，在控制性别特异性分化中起关键作用。克隆罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)Doublesex基因(MrDsx)的开放阅读框序列，构建重组质粒并诱导其表达，纯化获取罗氏沼虾重组蛋白MrDsx，可为后续开展罗氏沼虾MrDsx基因的功能研究提供基础数据。【方法】基于罗氏沼虾MrDsx的开放阅读框序列，通过特异PCR产物与表达载体pET-32a(+)连接，获得重组质粒pET-32a-MrDsx，将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，构建罗氏沼虾MrDsx基因的原核表达细胞。利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对阳性转化细胞进行诱导表达，并以SDS-PAGE电泳，Western blot和质谱分析检测诱导表达的重组蛋白。【结果】以罗氏沼虾性腺cDNA为模板，利用MrDsx基因的特异引物，PCR扩增获得了约660 bp大小的单一DNA条带。经测序确认为MrDsx基因的ORF序列。重组质粒pET-32a-MrDsx转化后的感受态细胞经IPTG在37℃条件下诱导4 h后获得罗氏沼虾重组蛋白MrDsx。当IPTG终浓度为0.1～0.5mmol/L时，重组蛋白MrDsx的表达量可达到峰值。可溶性分析显示，重组蛋白MrDsx主要以包涵体形式表达，经8 mol/L尿素溶解、Ni柱纯化及透析复性后，SDS-PAGE电泳和Western blot检测发现重组蛋白的相对分子量约55 kD，且条带单一，表明重组蛋白MrDsx能被鼠抗His-tag单克隆抗体特异性识别。质谱分析结果显示，片段化肽段与理论的氨基酸序列相符，匹配度达到100%。【结论】成功获得了MrDsx基因原核表达的重组质粒pET-32a-MrDsx。诱导表达的重组蛋白经溶解、纯化及复性后，可形成高纯度的活性罗氏沼虾MrDsx重组蛋白，为后续开展罗氏沼虾MrDsx基因的功能研究、互作蛋白的筛选和性别调控机制的解析提供初步依据。
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