养阴化瘀解毒方通过PI3K/Akt信号通路调控低氧环境下结肠癌细胞的自噬和凋亡

作者：陈宣; 刘红宁; 尚广彬; 柳歌; 胡佳; 张钟康; 严小军^*

来源：中国实验方剂学杂志, 2023, 29(20): 45-53.

DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20230225

• 结肠癌
• 低氧微环境
• 养阴化瘀解毒方
• 增殖
• 自噬
• 凋亡

目的：观察不同氧浓度环境对结肠癌细胞增殖、自噬的影响，并基于磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路探讨养阴化瘀解毒方在低氧环境下对结肠癌细胞自噬及凋亡的影响。方法：HCT-116细胞分为常氧组、1%低氧组、5%低氧组，通过细胞增殖与毒性检测（MTS）法检测细胞存活率，单丹磺酰尸胺（MDC）染色观察不同氧浓度下细胞自噬荧光表达情况；在5%低氧微环境下用养阴化瘀解毒方干预HCT-116细胞，分为正常组、空白血清组、养阴化瘀解毒方组（养阴化瘀解毒方含药血清5%、15%、25%）；通过MTS法计算各组细胞的抑制率；单丹磺酰尸胺（MDC）染色检测各组自噬细胞率的变化；利用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）/碘化丙锭（PI）流式细胞术检测各组细胞凋亡率；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测不同组自噬蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3Ⅱ/Ⅰ)、酵母Atg6同源物（Beclin-1）、泛素结合蛋白（p62）和凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2/腺病毒E1B相互作用蛋白3(BNIP-3)、Bcl-2关联X蛋白（Bax）、活化的胱天蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)及缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和通路蛋白磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、磷酸化PI3K(p-PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)表达情况。结果：与常氧组比较，1%、5%低氧组细胞存活率均明显上升，以5%低氧组细胞存活率提升幅度最大（P<0.01）；与常氧组比较，1%、5%低氧组细胞自噬荧光强度均明显增强，且以5%低氧环境下MDC染色自噬荧光表达最强；低氧环境下，与空白血清组比较，养阴化瘀解毒方组（15%、25%）细胞抑制率明显提高、自噬细胞率降低、细胞凋亡率升高（P<0.01）；养阴化瘀解毒方组（15%、25%）Beclin-1蛋白表达降低（P<0.05）；与养阴化瘀解毒方组（5%）比较，养阴化瘀解毒方组（25%）Beclin-1蛋白表达降低（P<0.05）；与空白血清组比较，养阴化瘀解毒方组（5%、15%、25%）LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达均降低（P<0.05,P<0.01）；养阴化瘀解毒方组（15%、25%）p62蛋白表达升高（P<0.01）；与养阴化瘀解毒方低剂量组比较，养阴化瘀解毒方组（25%）p62蛋白表达升高（P<0.05）；与空白血清组比较，养阴化瘀解毒方组（25%）促凋亡蛋白BNIP-3、Bax表达升高，抑凋亡蛋白Bcl-2表达降低（P<0.01）；与养阴化瘀解毒方组（5%）比较，养阴化瘀解毒方组（25%）Bax蛋白表达上升（P<0.05）；与空白血清组比较，养阴化瘀解毒方组（15%、25%）低氧因子HIF-1α表达降低（P<0.01）；养阴化瘀解毒方组（25%）p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt表达上升（P<0.05,P<0.01）；与养阴化瘀解毒方中剂量比较，养阴化瘀解毒方组（25%）p-Akt/Akt表达上升（P<0.05）。结论：低氧微环境能明显促进结肠癌细胞自噬及增殖，发挥细胞保护作用，养阴化瘀解毒方在5%低氧环境下能明显抑制结肠癌细胞自噬和增殖，并促进细胞凋亡，其机制可能与上调PI3K/Akt信号通路有关。

• 单位
  江西中医药大学中医基础理论分化发展研究中心; 江西省中医病因生物学重点实验室