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摘要
目的确定问号钩端螺旋体(简称钩体)赖株AhpC蛋白的过氧化物还原酶活性及其在问号钩体感染宿主细胞过程中是否具有抵抗氧化应激的功能。方法构建问号钩体黄疸出血群赖型赖株ahpC基因原核表达系统。Ni-NTA亲和层析法提纯目的重组蛋白rAhpC,检测其酶学活性和保护DNA不被氧化的功能。用定点突变方法验证AhpC的过氧化半胱氨酸和还原性半胱氨酸。经不同浓度的Conoidin A抑制问号钩体过氧化物还原酶活性后,比较抑制前后构体内的活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)水平和钩体存活率的变化。结果所构建的原核表达系统能有效表达rAhpC。rAhpC具有过氧化物还原酶的活性,其催化反应依赖于硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶系统。AhpC分子中含有的两个半胱氨酸对维持酶的活性起着至关重要的作用,其中Cys47是AhpC的过氧化半胱氨酸,而Cys167是还原性半胱氨酸。AhpC能够保护质粒DNA免遭过氧化氢的氧化损伤。经不同浓度的Conoidin A抑制问号钩体的过氧化物还原酶的活性后,钩体在巨噬细胞内的存活率明显下降,并且呈现出剂量依赖的效应,表明钩体存活率的降低与钩体的过氧化物还原酶活性丧失从而无法有效降解构体内活性氧水平有着密切的关系。结论问号钩体的AhpC具有过氧化物还原酶的活性,能抵抗宿主细胞引起的氧化损伤,与钩体在巨噬细胞内的存活有关。
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