可回复性胰岛细胞永生化载体phTERT-I-GTKlox的构建与鉴定

作者：吴惠玲; 陈兵; 粟永萍; 王军平; 艾国平; 陈耀凯; 杨仕明

来源：免疫学杂志, 2008, (02): 226-229.

• 可回复性永生化
• 条件基因敲除
• 人端粒酶逆转录酶

目的构建以人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)为永生化基因、loxP为重组位点的可回复性永生化逆转录病毒载体。方法采用EcoRⅠ、SalⅠ双酶切、回收含有EGFP-胸苷激酶融合基因及LoxP序列的逆转录病毒载体pBTGTKlox,将经PCR扩增的IRES序列克隆入其中,构建成pI-GTKlox;将hTERT克隆入pI-GTKlox的EcoRⅠ酶切位点,构建成phTERT-I-GTKlox。进行菌落PCR、酶切、测序鉴定。结果菌落PCR鉴定5个菌落中2个为阳性克隆。阳性克隆质粒经EcoRⅠ酶切鉴定形成预计的6.5kb及3.5kb两个片段,进一步经测序证实插入的hTERT序列无核苷酸突变。结论成功构建了phTERT-I-GTKlox可回复性永生化逆转录病毒载体,为建立可回复性永生化胰岛细胞奠定了基础。

• 单位
  第三军医大学; 第三军医大学西南医院