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摘要
目的探讨草酸钙(CaOx)晶体诱导人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)发生铁死亡的机制。方法 2021年3—9月使用CaOx晶体悬浊液干预HK-2细胞, 构建HK-2-CaOx反应模型。设置CaOx晶体浓度分别为0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L, 干预HK-2细胞24 h, 干预完成后提取HK-2细胞蛋白。采用最佳干预浓度的CaOx晶体干预HK-2细胞, 分别于干预后0、3、6、9、12、24、48 h提取细胞蛋白。蛋白质印迹法检测细胞内铁死亡标志蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的表达情况。用铁死亡诱导剂爱拉斯汀(Erastin)和铁死亡抑制剂3-氨基-4-环己基氨基苯甲酸乙酯(Fer-1)干预HK-2细胞以调控细胞内铁死亡水平。将HK-2细胞分为4组:正常对照组(NC组), 无干预处理, 单纯使用完全培养基培养;CaOx晶体刺激组(CaOx组), 使用含4.0 mmol/L CaOx晶体的完全培养基培养;CaOx晶体+Erastin处理组(CaOx+Erastin组), 使用含10.0 μmol/L Erastin和4.0 mmol/L CaOx晶体的完全培养基培养;CaOx晶体+Fer-1处理组(CaOx+Fer-1组), 使用含1.0 μmol/L Fer-1和4.0 mmol/L CaOx晶体的完全培养基培养。培养24 h后, 采用蛋白质印迹法和免疫荧光技术检测GPX4、长链脂酰辅酶A合成酶4 (ACSL4)和溶质载体家族7成员11(SLC7A11)在HK-2细胞内的表达情况;检测HK-2细胞内谷胱甘肽含量;采用DCFH-DA荧光染色法观察HK-2细胞活性氧(ROS)表达情况。通过光学显微镜观察各组HK-2细胞内CaOx黏附情况, DAPI染色检测HK-2细胞核损伤情况。结果采用0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L浓度CaOx晶体干预24 h后, 细胞中GPX4的表达量分别为5.67±1.05、5.60±0.02、4.99±0.94、4.82±0.93、4.50±0.70、4.14±0.53、0.97±0.53, 4.0 mmol/L组与0 mmol/L组相比差异有统计学意义(P=0.026)。选用4.0 mmol/L作为最佳浓度干预细胞, 干预0、3、6、9、12、24、48 h后细胞中GPX4的表达量分别为11.73±1.29、11.68±1.32、11.72±1.30、10.97±1.28、10.63±1.21、8.79±1.10、8.03±1.06, 24 h组与0h组相比差异有统计学意义(P=0.090)。CaOx+Erastin组与NC组相比, ACSL4表达量(9.71±0.68与3.96±0.17, P<0.01)升高;SLC7A11(5.76±1.31与9.18±1.54, P=0.001)和GPX4(3.61±0.25与9.26±0.13, P<0.01)表达量降低;CaOx+Fer-1组与CaOx组相比, GPX4(7.52±0.23与3.61±0.25, P<0.01)、SLC7A11(7.85±1.34与5.76±1.31, P=0.012)表达量升高, ACSL4(5.84±0.62与9.71±0.68, P=0.002)表达量显著降低。CaOx+Erastin组与CaOx组相比, GPX4(2.71±0.18与3.61±0.25, P=0.001)、SLC7A11(3.82±1.60与5.75±1.31, P=0.017)表达量显著降低, ACSL4(11.15±0.44与9.71±0.68, P<0.01)表达量升高。NC组、CaOx组、CaOx+Fer-1组、CaOx+Erastin组的谷胱甘肽含量分别为(81.88±4.02)、(53.38±3.53)、(68.26±4.55)、(38.22±2.95)mmol/L;DCFH-DA荧光染色强度分别为(22.72±3.73)、(63.36±5.17)、(82.38±6.25)、(45.32±4.33);免疫荧光强度分别为(50.36±4.23)、(31.63±2.86)、(23.36±3.74)、(39.89±3.35), CaOx组与NC组、CaOx+Fer-1组、CaOx+Erastin组相比差异均有统计意义(P<0.05)。DAPI染色计算NC组、CaOx组、CaOx+Fer-1组、CaOx+Erastin组细胞核损伤比例分别为2.85%、11.96%、8.76%、16.27%。结论 CaOx晶体可以通过增加HK-2细胞内氧化应激水平进而诱导HK-2细胞发生铁死亡。
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单位广西医科大学第一附属医院; 金华市人民医院
