利用CRISPR/Cas9基因编辑技术抑制EV71复制

作者：吴涛; 朱小娟; 樊欢; 葛以跃; 陈银; 郭喜玲; 赵康辰; 史智扬; 朱凤才; 崔仑标

来源：中华微生物学和免疫学杂志, 2016, 36(11): 859-864.

DOI：10.3760/cma.j.issn.0254-5101.2016.11.012

• CRISPR/Cas9基因编辑技术
• 肠道病毒71型
• 病毒复制
• 抑制

目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对肠道病毒71型(EV71)的特定基因进行编辑,评价其抑制EV71复制的效应。方法针对EV71的VP4区设计CRISPR/Cas9表达质粒pCasGuide-GFP-G1及含PAM序列的DNA片段并转染Vero细胞株。采用噻唑蓝(M TT)法测定细胞毒性,转染后接种病毒观察细胞病变作用(CPE),荧光定量RT-PCR法检测EV71含量,免疫共沉淀结合荧光定量RT-PCR法测定Cas9-gRNA在细胞内与EV71 RNA特异性结合的能力。结果成功构建pCas-Guide-GFP-G1表达质粒;转染细胞后未见明显细胞毒性效应;细胞转染后接种病毒发现pCasGuide-GFP-G1+PAN1组细胞病变明显少于其他对照组;培养上清中EV71含量较对照组降低了40.4%(P=0.056),细胞中EV71含量较对照组降低了52.8%(P=0.014);pCas-Guide-GFP-G1+PAM1组在细胞内与EV71 RNA特异性结合能力最高。结论针对EV71的VP4基因设计的CRISPR/Cas9表达质粒在特定PAM存在下能通过对EV71基因组的剪切实现抑制EV71病毒复制的作用,可以为EV71治疗提供新的途径。

• 单位
  江苏省疾病预防控制中心