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摘要
为探究牛支原体(M. bovis)脂质相关膜蛋白(LAMPs)抑制宿主细胞凋亡的分子机制，本研究利用实验室前期经AKTA分子筛分成5组的M. bovis TJ株LAMPs分别刺激胎牛肺(EBL)细胞，经western blot检测各组LAMPs对EBL细胞中凋亡执行分子Caspase-3剪切激活水平的影响，经CCK-8试验检测筛选出的目标LAMPs对EBL细胞活力的影响，并对其进行蛋白质谱测序分析。结果显示，D组LAMPs能够抑制Caspase-3的剪切激活水平，并可以极显著提高EBL细胞活力，结合蛋白质谱测序结果以及生物信息学软件预测蛋白功能，选定VSPHB0801-4、TPP、DJ-1、EF-TU、GAPDH以及GLCP为候选蛋白进行后续试验。经PCR扩增dj-1基因，重叠延伸PCR扩增ef-tu和glcp融合基因，vsphb0801-4、tpp和gapdh基因片段则由华大基因公司合成，将上述基因片段分别克隆至相应的原核表达载体中，构建重组质粒p ET-28a-vsphb0801-4、 p ET-28a-tpp、 p ET-32a-dj-1、 p ET-32a-ef-tu、 p EGX-6P-1-gapdh和p MAL-c5X-glcp，并分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导后通过亲和层析纯化目的蛋白，SDS-PAGE检测重组蛋白的纯化效果。结果显示，获得了纯度较高的6个重组蛋白。将不同浓度的6个重组蛋白分别刺激EBL细胞，经western blot验证重组蛋白是否具有抑制EBL细胞凋亡的作用，结果显示，只有重组蛋白GLCP能够抑制EBL细胞凋亡。因此，将其作为靶标蛋白进一步探究其抑制EBL细胞凋亡的分子机制。将不同浓度的重组蛋白GLCP分别刺激EBL细胞后，经western blot检测经典凋亡通路介导分子Caspase-8、Caspase-9和Caspase-12的剪切激活水平、激光共聚焦显微镜检测EBL细胞线粒体膜电位，以及western blot检测线粒体介导的凋亡通路关键分子Bcl-2、Bax、Cyt C、Apaf-1以及剪切的多聚ADP核糖聚合酶-1 (PARP1)蛋白的表达水平。结果显示，重组蛋白GLCP主要抑制Caspase-9的剪切激活水平，提高线粒体膜电位，并上调线粒体介导的凋亡通路关键分子Bcl-2蛋白的表达水平，以及下调Bax、Cyt C、Apaf-1和剪切的PARP1蛋白表达水平。以上实验结果表明，重组蛋白GLCP主要通过线粒体介导的凋亡通路抑制EBL细胞凋亡。本研究首次筛选到抑制EBL细胞凋亡的M. bovis脂质相关膜蛋白GLCP，并初步解析了其抑制宿主细胞凋亡的分子机制，为M. bovis持续性感染机制的研究提供参考依据。
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