联合共检四种猪腹泻病毒的寡核苷酸芯片的构建及应用

作者：胡靖飞; 滑翔; 黄小波^*; 赵玉佳; 曹三杰; 文心田; 文翼平; 伍锐; 赵勤

来源：农业生物技术学报, 2020, 28(02): 349-359.

• 猪流行性腹泻病毒(PEDV)
• 猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)
• 猪轮状病毒(PoRV)
• 猪δ冠状病毒(PDCoV),寡核苷酸芯片

生产中常见仔猪(Sus scrofa)腹泻,造成严重经济损失。本研究建立了联合检测猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus, TGEV)、猪轮状病毒A群(Porcine rotavirus A group, PRoV A)与猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus, PDCoV) 4种猪肠道病毒的寡核苷酸芯片并进行了临床应用。根据PEDV的纤突蛋白(spike, S)、囊膜蛋白(membrane,M)基因、TGEV的S、核衣壳蛋白(nucleocapsid, N)基因、PRoV A的外衣壳蛋白(outer capsid protein, VP7)、非结构蛋白(non-structural protein, NSP4)基因与PDCoV的囊膜蛋白M、N基因设计8对特异性引物,再根据每对引物扩增基因的保守区域设计寡核苷酸探针,并用Cy-3荧光直接标记下游引物5’端进行多重PCR扩增标记样品。研究确定最佳制备和反应参数:100μmol/L探针原液与点样缓冲液比例为1∶2,水合处理10 h,杂交温度为42℃,杂交时间为120 min,以信噪比值(Signal-to-noise ratio, SNR)≥2或信号值>1 300判为阳性。该芯片灵敏性试验表明最低检测量为106copies/μL;特异性实验表明对非目标病原无交叉反应,保存期试验表明制备的芯片置于4℃下可保存至少60 d。用该芯片检测209份临床腹泻样品,结果显示PEDV、TGEV、PoRVA、PDCoV的阳性率分别为68.42%、4.30%、0.95%和2.87%,检测结果与普通逆转录PCR (reverse transcription PCR)一致。本研究构建的寡核苷酸基因芯片为4种仔猪腹泻病原的高通量筛查提供了新技术。

• 单位
  农业部; 四川农业大学