人黄韧带细胞骨化发生过程中的自噬

作者：许**; 李学斌; 唐一钒; 赵寅; 周盛源; 陈雄生^*; 贾连顺

来源：中国组织工程研究, 2020, 24(08): 1174-1181.

• 组织构建
• 组织工程
• 黄韧带骨化
• 骨桥蛋白
• 自噬
• 信号通路
• 黄韧带细胞
• 国家自然科学基金

背景:黄韧带骨化发生的病理机制尚不清楚,临床上无有效的药物或非手术治疗的方法。目前研究发现,骨桥蛋白与自噬在成骨过程中均发挥重要作用,二者在黄韧带骨化中的作用尚不清楚。目的:通过对骨桥蛋白和自噬在黄韧带骨化发生机制的研究,尝试找出药物治疗的潜在作用靶点。方法:(1)黄韧带骨化病、胸椎骨折或单纯腰椎间盘突出症患者行后路全椎板切除减压获取黄韧带,将标本分为骨化组和非骨化组,每组各取8例标本,通过免疫组化染色观察骨桥蛋白、骨钙素及自噬指标Beclin-1、LC3、P62的表达;(2)通过组织块贴壁法进行黄韧带细胞的分离培养,并用不同质量浓度的骨桥蛋白干预不同时间来构建体外黄韧带细胞骨化模型;(3)非骨化组黄韧带细胞用不同浓度的自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤干预后,再用100μg/L骨桥蛋白诱导,应用Western blot检测骨化指标碱性磷酸酶、骨钙素的表达变化;(4)用100μg/L骨桥蛋白干预非骨化黄韧带细胞,并在0,15,30,60,120min终止骨化诱导过程,应用Western blot检测MAPK信号通路中重要分子ERK1/2、JNK、P38的磷酸化情况;(5)非骨化组黄韧带细胞用ERK1/2特异的磷酸化阻滞剂U0126阻断ERK1/2通路磷酸化后,再用100μg/L骨桥蛋白诱导,应用Western blot检测碱性磷酸酶以及骨钙素的表达变化。结果与结论:(1)骨化黄韧带和非骨化黄韧带组织骨钙素、骨桥蛋白的免疫组化均呈阳性表达;骨化黄韧带组织中Beclin-1呈阳性表达,而LC3及P62未见明显阳性结果;非黄韧带骨化组织中Beclin-1、LC3、P62均呈阳性表达;(2)与非骨化组比较,骨化组黄韧带细胞中碱性磷酸酶和骨钙素的表达增加;骨桥蛋白可诱导黄韧带骨化,骨桥蛋白的作用具有浓度相关性和时间相关性;(3)自噬强弱与骨化程度呈负相关,即自噬越明显,骨化作用越弱;(4)骨桥蛋白能使MAPK信号通路磷酸化,并具有一定的时间相关性;抑制MAPK磷酸化过程后,骨桥蛋白仍然能够诱导黄韧带细胞的骨化;(5)结果表明,黄韧带骨化发生过程中,信号通路上ERK1/2、骨桥蛋白、骨钙素、碱性磷酸酶分子的上下游关系为:ERK1/2→骨桥蛋白→骨钙素/碱性磷酸酶。

• 单位
  上海长征医院; 中国人民解放军第二军医大学