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摘要
对香豆酸是一种具有多种药理活性的天然酚类化合物,也是多种天然药用产物生物合成的前体物质,广泛应用于食品、化妆品、医药等领域。通过微生物合成对香豆酸相对于化学合成和植物提取工艺具有节能减排等优势。但是,目前微生物合成对香豆酸产量较低,难以满足大规模工业发酵生产的要求。为了进一步提高对香豆酸产量,对粘红酵母酪氨酸解氨酶(Tyrosineammonia-lyase,TAL)进行定向进化改造,利用高通量筛选方法从随机突变体文库中筛选TAL催化活性提高的突变体。通过初筛和复筛两轮筛选,从大约10 000个突变体中获得1个TAL催化活性提高1倍的突变体。该突变体包含3个氨基酸突变位点,分别为S9Y、A11N、E518A。进一步通过单点氨基酸饱和突变验证,当S9位点突变为Y、I、N和A11位点突变为N、T、Y时,TAL的催化活性提高1倍以上。通过对S9和A11位点3种类型突变进行组合突变验证,S9Y/A11N和S9N/A11Y突变体的TAL催化活力显著高于其他组合。将S9N/A11Y突变体质粒转入酪氨酸高产菌株CP032。通过摇瓶发酵,该菌株在48 h时的对香豆酸产量达到394.2 mg/L,比对照菌提高2.2倍。本研究工作对促进微生物合成对香豆酸的代谢工程研究具有一定的参考价值。
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单位中国科学院天津工业生物技术研究所; 天津科技大学; 生物工程学院
