利用Crispr/Cas9构建POMP基因组原位荧光报告系统及其应用

作者：赵湘湘; 沈俊杰; 彭维; 蒋璐频; 钱程

来源：第三军医大学学报, 2016, 38(02): 141-147.

DOI：10.16016/j.1000-5404.201506008

• Crispr/Cas9
• 蛋白酶体成熟蛋白
• mCherry
• HEK293

目的利用Crispr/Cas9系统建立蛋白酶体成熟蛋白(proteasome maturation protein,POMP)基因组原位荧光报告系统。方法构建POMP-2A-mCherry-T载体并转染HEK293(human embryonic kdiney 293 cell)细胞;流式细胞仪分选获取m Cherry阴阳性细胞;实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR)检测mCherry阴阳性细胞中POMP基因转录水平表达差异;Western blot检测mCherry阴阳性细胞中POMP蛋白表达差异以及Huh7细胞中JNK1/JNK2磷酸化水平;蛋白酶体活性试剂盒检测mCherry阴阳性细胞中蛋白酶体活性差异。结果 mCherry阳性细胞POMP蛋白表达水平比mCherry阴性细胞高1.3倍(P<0.01),但其基因转录水平差异并不显著(P>0.05);同时mCherry阴性细胞中泛素化水平比mCherry阳性细胞高1.2倍(P<0.01);另外mCherry阳性细胞中蛋白酶体活性也显著高于阴性细胞(P<0.01);低表达POMP的Huh7细胞中,JNK1和JNK2的磷酸化水平分别升高1.5倍和1.4倍(P<0.01)。结论成功构建POMP荧光报告系统;将该系统用于Huh7细胞,发现POMP可改变JNK1、JNK2磷酸化水平,其可能通过JNK信号通路来影响细胞的增殖以及凋亡。

• 单位
  第三军医大学西南医院; 浙江理工大学; 生命科学学院