GDF5过表达与ZIP8基因沉默双重功能慢病毒载体的构建及鉴定

作者：向小聪; 邓丽; 冯刚; 肖东琴; 刘康; 陈竹; 杨飞

来源：西部医学, 2017, 29(12): 1645-1650.

• 骨关节炎
• 慢病毒
• iPSCs
• GDF5
• ZIP8

目的构建过表达生长分化因子5(GDF5)与基因沉默锌离子转运蛋白(ZIP8)的双重功能慢病毒载体,检测其在诱导多能干细胞中的表达效率并建立稳定细胞系,为骨关节炎的细胞治疗提供种子细胞奠定相关研究基础。方法以人的GDF5cDNA为模板合成GDF5全长序列,设计合成靶向小鼠ZIP8的shRNA序列,依次分别与双酶切的载体pRNAU6.2相连,构建双重功能慢病毒载体。将重组质粒及阴性对照质粒分别与慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞,收集病毒上清后感染iPSCs细胞,实时定量PCR和免疫印迹分别检测GDF5蛋白和ZIP8mRNA的过表达与沉默效果。经G418筛选获得稳定高效表达GDF5与基因沉默ZIP8的诱导多能干细胞(iPSCs)稳定细胞株。结果成功构建了双重功能慢病毒载体pRNAU6.2-CMV-hGDF5-mshZIP8-U6,经感染和G418筛选获得稳定表达高效表达GDF5与基因沉默ZIP8的iPSCs稳定细胞株。结论成功构建的pRNAU6.2-hGDF5-mshZIP8-U6慢病毒载体,可有效上调GDF5与下调ZIP8的蛋白和mRNA的表达,成功建立稳定高效表达GDF5与基因沉默ZIP8的iPSCs细胞株,为骨关节炎的细胞治疗建立可靠的细胞平台。

• 单位
  第二临床医学院; 南充市中心医院; 川北医学院